质粒(plasmid)是一种染色体外、具有双链闭环结构的DNA分子。质粒具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛地用作基因工程中目的基因的运载工具─载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA也是一种分子生物学最基本的方法。质粒DNA 的提取是依据质粒DNA 分子较染色体DNA 为小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA 与大肠杆菌染色体DNA 分离。质粒DNA 提取方法有以下几种：碱变性法、溴乙啶-氯化铯密度梯度法、DNA质粒释放法、羟基磷灰石柱层法及酸酚法。
一、碱变性法提取质粒DNA
【基本原理】
普遍采用的碱变性法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理是，利用染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱变性条件下(pH12.6)，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA 与大分子RNA、蛋白质SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。分离质粒DNA 的方法一般包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。
【器材】
1.1.5ml Eppendorf 管
2.微量加样器
3.培养皿
4.台式高速离心机
5.高压灭菌锅
【试剂】
所有的试剂均需高压灭菌(有机溶剂除外)
1.溶液I 50mmol /L 葡萄糖
25mmol/L Tris -Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
2.溶液II 0.2mol/L NaOH
1%SDS
临用前配制
3.溶液III 5mol/L 乙酸钾60ml
3mol/L 冰乙酸11.5ml
ddH2O 28.5ml
pH 5.2
4.RNase A： 10mg/ml
5.TE缓冲液： 1mmol/L EDTA in 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
6.Tris-Cl(pH8.0)饱和苯酚
7.氯仿/异戊醇(v/v)： 24/1
8.70%：乙醇
9.LB/Amp： LB/氨苄青霉素(50μg/ml)
【操作步骤】
1.从选择性培养平板上取出一个菌落，移至含有2ml LB/Amp 培养基的试管中。在37℃条件下振荡培养12-16h。
2.将1.5ml培养物移至1.5 ml Eppendorf管中，4000 rpm离心8min。
3.弃上清，将细菌沉淀悬浮在100μl 预冷的溶液I 中，并加入2.5μl RNase A(10mg/ml)。
4.加200μl 新配制的溶液II, 盖紧管口。快速颠倒离心管5 次使内容物混合、放置冰上5min。
5.加150μl预冷的溶液III，盖紧管口。将管颠倒5-8 次，冰上放置20min。
6.离心(1000rpm，4℃，5min)，将上清转移到另一离心管中。
7.加等体积苯/氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心同上。
8.将水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇混匀后置冰上20min。
9.10 000rpm 4℃离心10min。
10.弃上清，加入0.5ml 70%乙醇洗涤DNA 沉淀，离心弃上清，在空气中使质粒DNA干燥10min。
11.将质粒DNA溶于20μl，ddH2O 中，4℃保存。
二、质粒DNA小量纯化试剂盒提取质粒DNA
【基本原理】
此试剂盒用于质粒DNA小量纯化。该试剂盒采用了传统的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需1小时便可完成。使用本试剂盒可从1-4ml 的过夜培养的菌液中纯化得到1～20μg的高纯度质粒DNA，此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。
【器材】
1.离心机
2. Spin Column
3. Collection Tube (2ml)
【试剂】
1.RNase A1 (50mg/ml)*1 6μl
2.Solution I*1 3ml
3.Solution II*2 3ml
4.Solution III 4.8ml
5.Rinse A 5.5ml
6.Rinse B 16ml
7.Elution Buffer*3 0.8ml
*1 初次使用试剂盒时，请将RNase A1 全部加入到SolutionI 中，混合均匀后4℃保存。
*2若出现沉淀，请于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用。
*3 Elution Buffer组成：2.5mmol/L Tris-Cl(pH 8.5)。
【操作方法】
1.大肠杆菌的培养。
从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4 ml 的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。注)培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
2.取 1～4 ml的过夜培养菌液，12 O0O rpm离心2min，弃上清。
3.用250μl的Solution I (含RNase A1)充分悬浮细菌沉淀。注)注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4.加入250μl的Solution II 轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注)此步骤不宜超过5min。
5.加入400μl 的4℃预冷的Solution III ，轻轻上下翻转混合5～6 次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min。
6.室温 12 000 rpm 离心5min，取上清。注)此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7.将试剂盒中的 Spin Column按置于Collection Tube 上。
8.将上述操作 6的上清液转移至 Spin Column 中，360Orpm 离心 1min (如SpinColumn中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1min )，弃滤液。
9.将500μl 的Rinse A加入Spin Column中，3600rpm离心3OSec ，弃滤液。
10.将700μl的Rinse B加入SPin Column中， 360Orpm 离心3OSec，弃滤液。
11.重复操作步骤10，然后 12000 rpm再离心 1min。
12.将Spin Column 按置于新的1.5 ml 的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入 60 μl的水或洗脱液，室温静置1min。注)把水或洗脱液加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
13.12 O00 rpm 离心1min 洗脱收集DNA。
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