生物安全柜前的空气幕很脆弱，极易受到干扰而造成污染。实验中不能随意开启前窗的位置，操作动作缓和，手臂避免频繁出入安全柜，以防止打扰气流。在安全柜工作时，开关房门、人员在房间内走动、甚至在操作人员背后咳嗽等都会形成湍流而增加微生物气溶胶溢出量，而造成实验室污染。
1.位置
空气通过前面开口进入生物安全柜的速度大约为0.45m/s。这样速度的定向气流是极易受到干扰的，包括人员走近生物安全柜所形成的气流，打开窗户，送风系统调整以及开关门等都可能造成影响。
因此，最为理想的是，生物安全柜应位于人员活动，物品流动以及可能会扰乱气流的地方。在安全柜的后方以及每一个侧面要尽可能留有30cm的空间，以利用对安全柜的维护。在安全柜的上面应留有30-35cm的空间，以便准确测量空气通过排风过滤器的速度，并便于排风过滤器的更换。
2.操作人员
生物安全柜如果使用不当，其防护作用就可能大大地受到影响。操作人员在移动双臂进出安全柜时，需要小心维持前面开口处气流的完整性，双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口。
手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟，以便安全柜调整完毕并且让里面的空气“扫过”手和双臂的表面以后，才可以开始对物品进行处理。要在开始实验之前将所有必须的物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出前面开口的次数。
3.物品放置
二级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸，仪器设备或其他物品阻挡。放入安全柜内的物品应采用70%酒精来消除表面污染。可以在消毒剂浸湿的毛巾上进行实验，以吸收可能溅出的液滴。所有物品应尽可能地放在工作台后部靠近工作台边缘的位置，并使其在操作中不会阻挡候补格栅。可产生气溶胶的设备(例如混匀器，离心机等)应靠近安全柜的后部放置。像有生物危害性的废弃物袋，盛放废弃吸管的盘子以及吸滤瓶等体积较大的物品，应该放在安全柜内的某一侧。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。
耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及吸管盛放盘不应放在安全柜的外面，否则在使用这些物品时双臂就必须频繁进出安全柜，这样会干扰安全柜空气屏障的完整性，从而影响对人员和物品的防护。
4.操作和维护
大多数生物安全柜的设计允许全天24小时工作。研究人员还发现，连续工作有助于控制实验室中灰尘和颗粒的水平。向房间中排风或通过套管接口与专门的排风管相连接的一级A1和A2型生物安全柜，在不使用时是可以关闭的。其他如二级B1和二级B2型生物安全柜，是通过硬管安装的，就必须始终保持空气流动以维持房间空气的平衡。在开始工作以前以及完成工作以后，应至少让安全柜工作5分钟来完成“净化”的过程，应即应留在将污染的空气派出安全柜的时间。
5.紫外灯
生物安全柜中不需要紫外灯。如果使用紫外灯的话，应该每周进行清洁，以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。在安全柜重新认证时，要检查紫外线的强度，以确保有适当的光发射量。房间中有人时一定要关闭紫外灯，以保护眼睛和皮肤，避免因不慎暴露而造成伤害。
6.明火
在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中，应避免使用明火。使用明火会对气生影响，并且在处理挥发性物品和易燃物品时，也易造成危险。在对接种环进行灭菌时，可以使用微型燃烧器或电炉，而不应使用明火。
7.溢出
实验室中要张贴如何处理溢出物的实验室操作规则，每一位使用实验室的成员都要阅读并理解这些规程。一旦在生物安全柜中发生由生物学危害的物品溢出时，应在安全柜出于工作状态下立即进行清理。要使用有效的消毒剂，并在处理过程中尽可能减少气溶胶的生成。所有接触溢出物品的材料都要进行消毒/或高压灭菌。
8.安全柜防护效果的评估应该包括对安全柜的完整性，HEPA过滤器的泄漏，向下气流的速度，正面气流的速度，负压/换气次数，气流的烟雾模式以及警报和互锁系统进行测试。
还可以选择进行漏电，光照度，紫外线强度，噪声水平以及震动性的测试。在进行这些测试时，检测人员要经过专门的培训，采用专门的技术和仪器设备。
9.清洁和消毒
由于剩余的培养基可能会使微生物生长繁殖，因此在实验结束时，包括仪器设备在内的生物安全柜里的所有物品都应清楚表面污染，并移出安全柜。在每次使用前后，要清除生物安全柜内表面的污染。工作台面和内壁要用消毒剂进行擦拭，所用的消毒剂要能够杀死安全柜里可能发现的任何微生物。在每天试验结束时，应擦拭生物安全柜的工作台面，四周以及玻璃的内外侧等部位来清除表面的污染。在对目标生物体有效时，可以采用漂白剂溶液或70%酒精来消毒。在使用如漂白剂等腐蚀性消毒剂后，还必须用无菌水再次进行擦拭。推荐将安全柜一直维持运行状态。如果要关闭的话，则应在关机前运行5分钟以净化内部的气体。
10.清除污染
生物安全柜在移动以及更换过滤器之前，必须清除污染。最常用的方法是采用甲醛蒸汽熏蒸。应该由有资质的专业人员来清除生物安全柜的污染。
11.个体防护装备
在使用生物安全柜时应穿着个体防护服。在进行一级和二级生物安全水平的操作时，可穿着普通试验服。前面加固处理的反背式试验隔离衣具有更好的防护效果，应在进行三级和四级生物安全水平(防护服型实验室除外)的操作时使用。手套应套在隔离衣的外面，可以戴加有松紧带的套袖来保护研究人员的手腕。有些操作可能还需要戴口罩和安全眼镜。
12.警报器
可以在两种警报器中选择一种来装备生物安全柜。窗式警报器只能装在带有滑动窗的安全柜上。发出警报时表明操作者将滑动窗移到了不当的位置。处理这种警报时，只要将滑动窗移到适宜的位置就可以了。气流警报器报警时，表明安全柜的正常气流模式受到了干扰，操作者或物品当即处于危险状态。当气流警报响起时，应立刻停止工作，并通知实验室主管。
13.选择正确类型的生物安全柜，进行安装并正确使用，同时每年进行认证，这是一个复杂的程序。强烈推荐在经过良好培训并具有丰富生物安全操作经验的专家监督下来进行上述工作。该专家应非常熟悉“参考文献”部分中所列出的相关文献，并且经过了有关生物安全柜各方面的培训。操作者应接受生物安全柜操作和使用的正规培训。
