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 血清蛋白的提取、分离纯化与鉴定
  • 血清蛋白的提取、分离纯化与鉴定
  • 血清蛋白的提取、分离纯化与鉴定

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    上架时间:2014年01月10日
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    详细说明
    .血清ǐ-球蛋白的初步提取
    1. 血细胞与血清分离:
    取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞,上部为血清).
    2.
    乳糜粒分离:4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
    梯度液配置:离心管下部3/4容积加血浆,上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮,将乳糜粒吸出,留其余液体备用。
    3.
    血清蛋白分离:除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白质。
    5000rpm 10°C
    离心1h,密度梯度离心
    梯度.液配置:管容量1/3为血清,2/3131g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为121g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白,下部5/6为其它蛋白。
    4.2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9%氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml,加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min,此步骤可重复1~2次
    3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
    二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白
    (1)装柱:海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0ml洗脱液。边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内,打开柱底部出口,调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高,床面上保持有洗脱液,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.
    (2)上样与洗脱:小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面,关紧下端出口,用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品,将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面。柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口,将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次,以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。
    加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵,流速为0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml。
    (3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查:取比色板两个(其中一个为黑色背底),按洗脱液的顺序每管取一滴,分别滴入比色板中,前者加双缩脲2滴,出现蓝色混浊即示有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度;于另一比色板中,加人奈氏试剂l滴,以观察NH4+出现的情况。
        合并球蛋白含量高的各管,混匀。除留少量作电泳鉴定外,其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。
    三.纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析
    用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度,并用0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡,然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上,用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱,收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。
    四.浓缩
    DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ-球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定,常需浓缩。收集较浓的纯化的γ-球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2~ 0.25gSephadex G一25干胶,摇动2~3min, 3000r/min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。
    五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白
    (一)仪器与薄膜的准备
    1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择
    用竹夹子取一片薄膜,小心地平放在盛有缓冲液的平皿中,若漂浮于液面的薄膜在1530s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳;若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点等,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后,方可用于电泳。
    2.电泳槽的准备
    根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,因而称为滤纸桥。
    3.电极槽的平衡
    用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽,使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态,一般需平衡15——20min。注意,取出平衡装置时应将活塞关紧。
    ()点样
    1.制备点样模板
    取一张干净滤纸(10×10cm),在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线,此线为点样标志区。
    2.点样
    用竹夹子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时,先用玻璃棒或血色素吸管取23µL血清,均匀涂在加样器上,再将点样器轻轻印在点样区内,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样。
    ().电泳
    用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上,要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜,则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10min
    用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接,注意不要接错。在室温下电泳,打开电源开关,用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA8片薄膜则为4.8mA)。通电1015min后,将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA8片共8 mA),电泳时间约5080min。电泳后调节旋扭使电流为零,关闭电泳仪切断电源。
    ().染色与漂洗
    1.血清蛋白染色与漂洗脱色
    用解剖镊子取出电泳后的薄膜,放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中,浸染5min,取出后再用漂洗液浸洗脱色,每隔10min       换漂洗液一次,连续数次,直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上,用吹风机的冷风将薄膜吹干。
    ()透明
    将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡,约2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平。此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。
    (六)结果判断与定量
    血清蛋白电泳经蛋白染色后,可显示出区带,未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法,测定各蛋白组分相对百分含量。