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SABC(人IgG)-POD

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公司厂家直销SABC(人IgG)-POD,权威出售各系列检测试剂盒、各种Western Blot、酶联免疫试剂盒种类齐全,欢迎大家选购!
库存:现货(上海谷研科技有限公司可提供代做实验,详情可来电咨询)
运输:快递
SABC(人IgG)-PODWestern实验步骤:
Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 
   收集蛋白样品(Protein sample preparation) 
可以使用适当的裂解液,例如Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 
收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。 
   电泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝胶配制 
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 
(2) 样品处理 
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 
100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。 
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
   转膜(Transfer) 
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。 
   封闭(Blocking) 
转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。 
用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液,加入Western封闭液(P0023B),在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体,可以4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用SABC(人IgG)-POD鳞状细胞癌相关抗原(SCCAg)ELISA
肿瘤特异性抗原(TSA) ELISA
黑色素瘤转移表面黏附分子(MMSAM)ELISA
乳腺癌易感蛋白2(BRCA-2)ELISA
凋亡信号调节激酶I(ASK-1)ELISA
凋亡信号调节激酶I(ASK-1)ELISA
Bcl-2相关X蛋白(BAX)ELISA
转移因子(TF)ELISA
结肠癌抗原(CCA)ELISA
TGF-β诱导早期基因1(TIEG1)ELISA
肿瘤血管生长因子(TAF)ELISA
细胞角蛋白20(CK-20)ELISA
细胞角蛋白19(CK-19)ELISA
细胞角蛋白18(CK-18)ELISA
嗜铬蛋白A(CgA)ELISA
视网膜母细胞瘤抑制蛋白(pRB)ELISA
生长调节致癌基因α/黑素瘤生长刺激因子(GROα/CXCL1/MGSA)ELISA
成熟促进因子(MPF)ELISA
去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)ELISA
可溶性转铁蛋白受体(sTfR)ELISA