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进口原装 北京低促销 QIAGEN Plasmid Mega Kit (5) 高品质

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品  牌:德国Qiagen
所在地区:华北 北京
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详细说明
进口原装 北京低促销 QIAGEN Plasmid Mega Kit (5) 高品质

性能

EndoFree Plasmid Buffer Set将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化过程中,不需要额外步骤,也不需使用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Cartridge过滤细菌裂解液,通过重力流QIAGEN-tip阴离子交换技术纯化质粒DNA。

EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素,内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染(参见Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells")。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适合基因治疗研究和其他敏感应用。

质粒制备中的内毒素水平*
质粒制备方法 内毒素(EU?/μg DNA) 平均转染率?
EndoFree Plasmid Kit 0.1 154%
QIAGEN Plasmid Kit 9.3 100%
2x CsCl 2.6 99%
Silica-gel slurry 1230.0 24%
* 宿主菌:大肠杆菌DH5α  质粒:pRSVcat.
1 ng LPS = 1.8 EU. 
? 根据表中的数据计算 Plasmid purification method versus transfection efficiency.
无内毒素DNA配合原代细胞得到高转染率*
DNA纯化方法 细胞转染百分比
EndoFree Plasmid Kit 21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit 8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry 5.2% ± 0.74
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2(CLONTECH),pEGFP-N2由所示的方法制备。使用Effectene Transfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率,由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。(数据由C. Chew and J. Parente友情提供,Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.)
原理

纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法(参见"Endotoxin levels in plasmid preparations")。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤,获得<0.1 EU/μg的质粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置,用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀,清除细菌裂解液,相比离心可大量节约时间,减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Cartridges(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)可轻松有效的澄清细菌裂解液。

QIAGEN-tips中独特的阴离子交换树脂(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)专为核酸纯化而开发。它卓越的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips,最大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质,如苯酚,氯仿,溴化乙锭和CsCl,最大限度地减少对用户和环境的危害。

内毒素,又称脂多糖或LPS,是革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分,如大肠杆菌(参见Bacterial cell wall)。内毒素在质粒裂解纯化过程中释放,并显著地降低对内毒素敏感的细胞株的转染效率(参见Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency)。此外,内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂,影响转染实验。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞中的非特异性免疫反应,从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导蛋白质和脂类,如IL-1和前列腺素的合成。总体而言,内毒素在转染实验中是不可控变量,影响结果的可重复性,使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中,内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联,干扰研究。

操作流程

在碱性条件下,细菌细胞裂解,使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后,将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上,在适当的低盐和pH条件下,质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质,超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱(参见QIAGEN Plasmid Kit procedures)。DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。

应用

使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感的应用,包括:

转染,包括原代、敏感和悬浮细胞的转染
基因治疗研究 
基因沉默 
显微注射