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 鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体 AFP(Alpha Fetoprotein)
  • 鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体 AFP(Alpha Fetoprotein)
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    所在地区:上海
    上架时间:2013年05月10日
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    Western Blot操作方法:
    1.制胶及上样:
    (1)配制12%SDS-PAGE分离胶,混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间,其上加
    一薄层异丙醇,室温下静置至凝固。
    (2)待分离胶完全聚合后,倾去其上的水层,以吸水纸吸净残余液体,插入加样梳,缓缓加入浓缩胶,使其充满加样梳间的空隙,室温下静置。待胶完全聚合。
    (3)将凝胶固定于电泳装置上,上、下槽加入电泳缓冲液。
    (4)小心拔去加样梳,使加样孔竖直,以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
    (5)分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker,按4:1体积比加入5´样品缓冲液,以1´样品缓冲液?配平上样体积(总体积20µ1)后,于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
    (6)将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
    2.电泳
    (1)接通凝胶电泳仪的电源,初始电压70V。(约30分钟)
    (2)溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V,继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。(约60分钟)
    3.转膜
    (1)从玻璃板中取出凝胶,将其浸泡于转移缓冲液中。
    (2)取与胶同样大小的硝酸纤维素膜,以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
    (3)按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵,保证每层之间没有气泡。
    (4)将转移夹放入转移槽,膜在正极、胶在负极,接冷却循环水,90V稳压转移2小时。
    4.染色
    (1)将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中,振摇染色5-10min。
    (2)蛋白质条带出现后,用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
    (3)按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
    5.封闭
    把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉,室温摇动2小时。
    6.洗膜与杂交
    (1)以T-TBS洗膜,10分钟´ 3次。
    (2)第一抗体封闭: SPARC单抗以T-TBS 1:200稀释,按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中,去除所有气泡,4℃振摇过夜。
    (3)以T-TBS洗膜,10分钟´ 3次。
    (4)第二抗体封闭:辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(1:4000),按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中,去除所有气泡,室温下振摇60分钟。
    (5)以T-TBS洗膜,10分钟´ 3次。
    7.化学发光与曝光
    (1)将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml,按1:1的比例混合,在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。
    (2)用滤纸沾干膜上的液体,用保鲜膜包好,用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。
    (3)曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟,定影液中定影1分钟,用水冲洗后晾干。
    (4)根据曝光情况调整曝光时间,重复压片、显影及定影,选择满意的胶片。
    (5)重复实验三次。
    注意事项:
    western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态,空间结构改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。