上海维景生物科技有限公司

Western Blot, 免疫印迹实验服务,WB实验外包

Western Blot, 免疫印迹实验服务,WB实验外包

参考价格:¥150.00
促销价格:¥140.0000
促销时间:2016/6/1 -- 2016/7/31
品  牌:上海维景生物
产品型号:Western Blot, 免疫印迹实验服务,WB实验外包
适用范围:高教
所在地区:华东 上海 普陀区
上架时间:2016-06-30
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详细说明

Western Blot, 免疫印迹实验服务,WB实验外包

代做免疫印迹Western Blotting实验,代做WB实验

预实验免费!常用抗体免费!绝对保证质量,实验结果满意才支付尾款!
Western Blot标准protocol
成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件:

  1. 凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析
  2. 吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将无法在膜上进行分析
  3. 处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
  4. 处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测,则设置合适正确的对照是必不可少的,只要正确设置了这些对照,即可快速和准确的找到WB的问题所在,并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:

  • 阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率
  • 阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性
  • 二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性
  • 内参对照:检测标本的质量和二抗系统
  • 空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果

WB检测基本过程
1、获取细胞或组织裂解物
1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer:

蛋白位置 推荐buffer
全细胞 NP-40 or RIPA
胞浆(可溶性蛋白) Tris-HCl
胞浆(骨架结合蛋白) Tris-Triton
膜蛋白 NP-40 or RIPA
核蛋白 RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白 RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2)选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,进行免疫沉淀(IP)或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件:

待测蛋白状态 凝胶条件 上样buffer 电泳buffer
Reduced - Denatured 还原,变性 含β-巯基乙醇或DTT,含SDS 含SDS
Reduced - Native 还原,不变性 含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS 不含SDS
Oxidized - Denatured 不还原,变性 不含β-巯基乙醇或DTT,含SDS 含SDS
Oxidized - Native 不还原,不变性 不含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS 不含SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量(kDa) 凝胶浓度(%)
4-40 20
12-45 15
10-70 12.5
15-100 10
25-200 8

4、转膜
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下:

  PVDF膜 NC膜 尼龙膜
灵敏度和分辨率
背景 较高
蛋白结合能力 100-200ug/cm2(适用于SDS存在时与蛋白结合) 80-100ug/cm2 >400ug/cm2
机械强度 干的膜易脆 软而结实
溶剂抗性
使用前是否需要浸润 100%甲醛润湿 缓冲液润湿 缓冲液润湿
适用染色方法 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 不能用阴离子染料
适用检测方法 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 显色法、化学发光、荧光、放射性 显色、化学发光、放射性
适用范围 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价格 较低

5、封闭
去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有:含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:

  • 选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)
  • 选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证)
  • 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

一抗的保存和使用:

  • 根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入-20度保存,绝对避免反复冻融。
  • 抗体的工作液最好现配现用,在4度保存最好不要超过2周
  • 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书推荐的稀释比例只作参考,需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:100-1:3000)。
  • 孵育条件:推荐4°C孵育(一般大于18个小时),根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

内参的选择和使用:WB过程监测以及目的蛋白定量的标准!
WB常用内参及其技术参数:

内参名称 分子量大小 适用范围
beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞
GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞
Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞
VCDA1/Porin 31kDa 线粒体
COXIV 16kDa 线粒体
TBP 38kDa 细胞核

7、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时
8、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量
9、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
Note:从封闭开始,每步之间都需要用TBST进行洗涤,3次,每次5min


客户注意事项


1.标本收集与保存
组织样品:新鲜组织放入液氮或-80度保存,组织不少于100mg(约绿豆大小);
培养细胞:通过细胞计数取不少于2000000个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-80℃,避免反复冻融);
血液细胞标本:以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-80℃可长期保存,避免反复冻融)
血清或细胞培养液标本:离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(以上4℃可保存15-20天,-80℃可长期保存,避免反复冻融)

2.样本运输:可选以下任何的一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本使用干冰覆盖后通过泡沫盒运输;
细胞样本也可以直接常温寄送细胞培养瓶(parafilm密封瓶口保证不污染,培养液不外漏,细胞不必长得太满,50%左右即可,灌满培养液);

以上样本快递,视路途远近2-3天可到达。

上海维景生物科技有限公司是一家专注生命科学领域的企业,借助中科院细胞与免疫学实验平台拥有强大的资金背景支持和专业的团队等资源。公司面向全国市场,迅速发展,广纳英才,现已建成专业生命科学产品销售团队,其中大部份是在生命科学市场上工作多年,有丰富的销售经验,也有良好的客户资源,销售渠道全面覆盖华东大部分工业以及科研客户,团队中免疫学及相关专业硕士以上学历人士达50%,有较强的技术支持能力,在针对专业技术服务中能够提供完善周到的专业化服务,对客户在使用产品过程中提出的问题能满意答复,并可及时传递最新的产品技术资料信息。  

上海维景生物是一家面向全国以专业从事免疫学实验服务外包和免疫学试剂代理销售为主的高新技术企业。公司的服务对象主要为医药科研人员、大型制药公司等。

公司专注开展以下五种免疫学实验服务:免疫印迹(Western Blotting)、免疫组织化学(IHC)、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)、染色质免疫共沉淀(ChIP) 绝对保证实验质量,客户满意后才收取尾款。

同时公司还是美国CMCTAG品牌的全国独家总代理,CMCTAG公司产品专注于标签抗体、内参抗体及标签抗体偶联beads这一领域。其开发的标签抗体偶联agarose beads(affinity gel)在科研以及临床研究中享有很高的声誉,更借助CMCTAG在标签抗体、内参抗体领域的优势,成为免疫印迹WB和免疫沉淀IP实验试剂的专业供应商。因卓越的产品质量及良好的客户口碑,CMCTAG敢于执行倒赔政策,抗体承诺客户不满意即可申请无条件全额退款,如若产品质量证实有瑕疵,则除了无条件全额退款以外,还会倒赔客户一定金额。

维景生物是一家专注标签抗体偶联beads(affinity gel),标签抗体,HRP直标标签抗体,内参抗体等抗体销售,及WB,IP,Co-IP,ChIP实验外包服务的高科技生物公司,咨询热线:。 业务咨询 QQ :908869532