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  • 恩诺沙星试剂盒说明书

    中国教育装备采购网 2010/11/11 8:55:39 围观492次 我要分享

    恩诺沙星酶联免疫反应测试盒使用说明书
    .简介

    1.试剂盒描述
        恩诺沙星作为一种氟喹诺酮类物质,能抑制细菌DNA螺旋酶活性。它作为氟喹诺酮类代表类药物,用于由沙门氏菌、巴氏杆菌、支原体和嗜血杆菌类引起的动物传染病。恩诺沙星和他的主要代谢产物环丙沙星在肌肉组织、脂肪和牛奶中最大残留限量100ppb。MaxSignalTM恩诺沙星酶联免疫反应测试盒为养殖者和政府监督管理部门提供了低检出限0.5 ppb的快速检测技术。该试剂盒有以下特点:
    Ø         快速10-30分钟之内可完成从饲料、肌肉,牛奶、组织,血清和尿液中提取恩诺沙星的全过程且回收率达到75-95%。
    Ø         快速的检测(在不考虑样品数量的情况下只需不到2小时)。
    Ø         高重现性。
    2.试剂盒原理
    MaxSignalTM恩诺沙星酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理,含有恩诺沙星的抗原已经包被于微孔板上。药物分析时,样品同特异性一抗共同被添加到板孔中。如果样品中含有药物,会竞争一抗,抑制抗体与板上包被的药物抗原结合。加入酶标记的二抗,形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。加入底物后,产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比。
    3.试剂盒组成部分和储存
    (1)试剂盒包括:
    已包被抗原的酶标板(Enrofloxacin-coated Plate)(可拆式).... 12×8孔
    标准液(Standards)(0,0.1,0.25,0.5,1.0,5.0 ).............. 6×0.8mL
    回收用10ppb(Spiking)(可选)................................................. 1×0.8ml
    恩诺沙星一抗(Antibody #1)........................................................ 1×15mL
    100×HRP酶标二抗(HRP-Conjugated Antibody #2)................. 1×250µL
    酶标二抗稀释液*(Antibody #2 Diluent)..................................... 1×20mL
    20×浓缩洗液*(Wash Solution).................................................... 1×28mL
    终止液*(Stop Buffer).................................................................... 1×20mL
    底物*(TMB Substrate).................................................................. 1×12mL
    10×样品提取液(Sample Extraction Buffer)................................. 1×25mL
    *可以和其他BIOO产品的交叉使用(有效期内)
    (2)试剂盒的保存
    本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存,有效期为一年。如果超过3个月不使用试剂盒,请将一抗和二抗放置-20冷冻保存。
    (3)样品检测下限

    检测物质
    检测下限(ng/g
    饲料
    1.0
    肌肉/肝脏/肾脏/鱼类/虾
    1.0
    牛奶
    0.5
    血清
    0.5
    尿液
    0.5
    蜂蜜
    2.0

     
    (4)交叉反应数据
    药物
    交叉反应%
    恩诺沙星(Enrofloxacin)
    100
    环丙沙星(Ciprofloxacin)
    100
    达氟沙星(Danofloxacin)
    52
    诺氟沙星(Norfloxacin)
    10
    依诺沙星(Enoxacin)
    9
    吡哌酸(Pipemidic acid)
    9
    氧氟沙星(Ofloxacin)
    8
    培诺沙星(Benofloxacin)
    7
    氟甲喹(Flumequin)
    6
    恶喹酸(Oxolin acid)
    5
    萘啶酸(Nalidixic acid)
    3
    4.其他需要而本试剂盒未提的设备或材料
    ü          酶标仪
    ü          恒温培养箱
    ü          移液器(10、20和100mL,1mL各一支)
    ü          漩涡振荡器
    ü          匀质器
    ü          多道移液器(50-300mL)
     
    .警告
    实验前请阅读以下文字,以保证获得最佳实验效果。
    ü          标准品中含有恩诺沙星,请小心使用。
    ü          不要使用过期的试剂盒。
    ü          不同批次的试剂盒不要混用,抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保二抗及二抗稀释液正确配制。
    ü          尽量保持室温20-25℃,避免在通风口操作防止温度过低,过热和/或者蒸发。同样的,不要在阳光直射下实验,防止过热及蒸发。在孵育期间,如果工作台温度过低,应该铺垫若干纸巾或者其他物料。
    ü          水质量很重要,确保使用蒸馏或者去离子水。
    ü          加入样品或者试剂到空的微孔板时,吸嘴靠于微孔接近底部,并保持接触。
    ü          孵育时间的计算越规范越好,保持添加标准品的一致性,先添加标准品后添加样品。
    ü          从低浓度到高浓度地添加标准品,降低影响标准品曲线质量的风险。
    ü          将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中,冷藏保存。
     
    . MaxSignalTM  Enrofloxacin ELISA Test Kit检测方法
    1.试剂的准备
    所有的试剂在使用之前应将其回温至室温,并在使用试剂前摇动几下,以保证合理的浓度。
    (1)1×二抗工作液
    按1:99的比例来配制酶标二抗和二抗稀释液,配成二抗的工作液。
    (2)1×工作洗液
    按1:19的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。
    (3)1×样品提取液
    按1:9的比例配制样品提取浓缩液和双蒸馏水。
    (4)35%乙醇/样品提取液(用于检测尿样、血清、牛奶)
        混合6.5体积的1×样品提取液和3.5体积100%乙醇。
    2.样品的准备
    2.1 饲料
    (1)         1份样品中加入5份70%的甲醇(如1g样品+5mL70%甲醇),匀浆;
    (2)         取1.5ml匀浆样品,室温下(20-25℃)4000g离心5分钟;
    (3)         移取0.5mL上清液,加入0.5mL1×样品提取液,混合均匀;
    (4)         每孔加入50µL进行检测。
       稀释倍数:10.0
    2.2 肌肉/肝脏/肾脏/鱼类/
    (1)         去除样品中的脂肪,取合适的匀浆器对样品进行匀浆;
    (2)         取1g匀质样品,加入4mL70%甲醇;
    (3)         最大转速下剧烈震荡涡旋10分钟;
    (4)         室温下4000g离心5分钟;
    (5)         移取0.5mL上清液,加入0.5mL样品提取液,混合均匀,每孔取50µL样品用于检测。
    稀释倍数:10.0
    2.3 牛奶
    (1)         对于无脂牛奶,取200µL牛奶+800µL35%乙醇/样品提取液,混匀,每孔取50µL稀释样品进行检测;
    (2)         对于含脂牛奶,取1ml样品,4000g离心5分钟以去除上层脂肪层,取出200µL牛奶+800µL35%乙醇/样品提取液,混匀,每孔取50µL稀释样品进行检测。
    稀释倍数:5.0
    2.4血清
    (1)   取0.5ml样品,4000g离心5min
    (2)   取出0.2ml上清液,加入0.8ml35%甲醇/样品提取液混合液,每孔取出50µL检测。
        稀释倍数:5.0,根据实际需要样品可用35%甲醇/样品提取液混合液进一步稀释。
    2.5 尿样
    (1)         取0.5mL样品,4000g离心5分钟;
    (2)         取0.2mL上清液,加入0.8mL35%乙醇/样品提取液,每孔取50µL检测。
    稀释倍数:5.0
    2.6 蜂蜜
    (1)   称取0.1g蜂蜜样品,加入1.9ml的35%乙醇/样品提取液混匀
    (2)   每孔取50ul用于检测
    稀释倍数:20.0
     
    3.酶联免疫反应测试步骤
    以下为计算份量的表格,用户可根据自己的需要来确定需要配制多少试剂。
    试剂
    每个反应需要的体积
    24次反应的体积
    一抗
    100 mL
    2.4mL
    二抗工作液
    150 mL
    3.6 mL
    工作洗液
    2 mL
    48 mL
    终止液
    100 mL
    2.4 mL
    底物
    100 mL
    2.4 mL
     
    (1)         加入50mL的标准液或样品于所设定的孔中;
    (2)         在每孔中加入100mL一抗,轻轻敲击微孔板边缘1分钟;
    (3)         室温(20-25℃)孵育30分钟;
    (4)         洗板3次,每次应该加入250mL 1×洗液,最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干;
    (5)         每孔加入150mL 1×二抗(避免阳光直射和工作台温度过低,孵育时适当覆盖微孔板);
    (6)         室温(20-25℃)孵育30分钟;
    (7)         洗板3次,每次应该加入250mL,最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干;
    (8)         加入100mL的TMB底物(底物本身是无色的,出现颜色变化不能使用。孵育时适当覆盖微孔板);
    (9)         加入底物后立即计时,轻敲试剂盒使混匀;
    (10)      在室温下培养15分钟,加入100mL的终止液终止反应,在450nm下读OD值(读数前用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。
    4.结果计算
    (1)   分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
    (2)   相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100
    (3)   以相对吸光度值为纵坐标,标准浓度为横坐标建立标准曲线。
    (4)   从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
    (5)   样品检测下限和定量下限计算方法如下:
    样品检测下限 = (0.1ng/g) ´ (稀释倍数)
    样品定量下限 = (0.25ng/g) ´ (稀释倍数)
        备注:如结果呈阳性反应,应该用其他检验方法(如色谱/质谱方法等)进行确证。
    以下曲线图是恩诺沙星酶联免疫反应检测试剂盒典型标准曲线
     
     
    . 问题与解决
    1.标准品无颜色变化或者无相应数值

    可能原因
    解决方法
    试剂使用顺序混乱,或者操作步骤出错。
    遵循实验说明重复实验。
    使用了错误的抗体,或者二抗配制错误、失效。
    确保抗体来自同一试剂盒,所有抗体不同批次之间有一定的差异,确保二抗的配制无误。
    TMB底物失效。
    使用新的BIOO TMB底物。

     
    2.低吸光度(OD值)

    可能原因
    解决方法
    试剂过期,或者不同的批次混用。
    查证过期试剂和批次。
    洗液配制错误。
    使用试剂盒提供的洗液,正确配制。
    过多次洗涤。
    按照说明书要求进行洗涤。
    孵育时间过短。
    按照说明书要求,严格计算好时间。
    实验室温度过低。
    保持实验室温度在20-25℃,不要在空调风口或者寒冷的窗户旁进行实验。
    试剂或者微孔板温度过低。
    确保试剂或者微孔板完全回温,在实验开始前,将试剂放置盒子外最少1小时。
    使用错误波长读数,或者酶标仪失灵。
    确保450nm波长读数,检查酶标仪。
    试剂盒处于极端的条件。
    检查试剂盒从冰箱拿出使用的次数,检查试剂盒是否放置极端温度(过冷或者过热)时间太长。

     
    3.过高的背景值或吸光度(OD值)

    可能原因
    解决方法
    使用了质量差的水。
    如果使用的水可疑,尝试使用蒸馏水配制洗液。
    底物失效。
    确保加入微孔板前,底物是无色的。
    洗涤不当或者洗板机洗板效果不好。
    采用说明书建议的洗涤次数,每次每孔至少加入250μL洗液。检查洗涤系统,排除故障。
    酶标仪失灵。如果OD值读数很高而颜色很浅,那个这是非常可能的情况。
    使用校正微孔板检查酶标仪,检查光源。
    实验室温度过高。
    保持实验室温度20-25℃,避免在热源或者阳光直射处实验。
    试剂混淆,被污染或者配制不当。
    确保使用正确的试剂,准确配制,避免污染。

    4.板内差异性大

    可能原因
    解决方法
    加入标准品,试剂和样品的时间不一致。
    确保所有试剂可用,尽可能使用多道枪加样,加标准品,试剂和样品途中,不能中断。
    多道枪使用不当。
    校准多道枪,检查吸嘴是否套紧,确保吸液量一致。
    洗涤系统出现故障。
    检查洗涤系统,保持良好运行。

    5.板间差异性大

    可能原因
    解决方法
    板与板之间孵育时间相差太大。
    独立计时,确保一致的孵育时间。
    板与板之间不一致的洗涤过程。
    确保相同的洗涤次数,保证洗涤系统正常运作。
    使用移液枪不当。
    检查移液枪,确保吸取相同液量。
    微孔板,试剂,标准品和样品处于不同温度。
    确保微孔板,试剂,标准品和样品充分回到室温,如果试剂体积较大则需要回温较长时间。不能用温水浴回温样品。
    不同批次的试剂混用,或者试剂盒过期。
    注意试剂不要混用,不同的试剂盒可能显示不同的OD值,但是相对吸光值是有很好的对比性的。通常0标准品的OD值小于0.6显示试剂质量下降。

     
    6.一个或者多个标准品数据点超出曲线范围

    可能原因
    解决方法
    标准品添加顺序混乱,或者放置于错误位置。
    按照说明要求重复实验,保证标准品添加正确。
    标准品被污染或者与其他标准品混淆了。
    改用新的标准品,按照由低浓度到高浓度的顺序添加标准品。
    洗涤不一致或者洗涤系统失灵。
    遵循一如既往的洗涤方式,检查洗涤系统。
    加入标准品和试剂的时间不一致。
    确保一切就绪,由低浓度到高浓度添加标准品并保证不被打扰,使用多道枪移液。
    多道枪使用不当。
    校准多道枪,检查吸嘴是否套紧,确保吸液量一致。

     

     

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