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  • 动物细胞培养:细胞冻存与复苏

    中国教育装备采购网 2014/6/24 14:47:00 围观1543次 我要分享

    细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于一196~C液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。

     

    材料:冻存管,离心管,细胞培养用材料,500 mL烧杯,胶布,搪瓷杯,75%酒精棉。

     

    药品:培养基(RPMI1640或DMEM),小牛血清,0.25%胰蛋白酶溶液,二甲基亚砜(DMSO)或甘油,0.5%台盼蓝染液,液氮。

     

    仪器:4℃冰箱,-70℃冰箱,液氮容器,微量加样器,水浴锅,离心机。

     

    (一)细胞冻存

     

    1.取待冻存的细胞用胰酶消化(见相关实验细胞传代培养部分),用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5 min,弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞,则可直接离心收集细胞。

    2.加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基,或者10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大,3×106个/mL左右,并可适量增加牛血清浓度至20%。

    3.细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹,做好标记(写上细胞种类、时间及冻存条件等)。

    4.冻存管在4℃下存放30 min,转放-20℃ 1.5~2 h,再转人-70℃ 4-12 h后即可转移到液氮内(-196℃),注意进行登记。

     

    (二)细胞复苏

     

    1.取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。

    2.从液氮中取出冻存管立即投人40℃水中迅速解冻。

    3.取出冻存管,用75%酒精清洁管口,打开。

    4.离心去上清收集细胞,用无血清培养基洗1次,加人3 mL新鲜培养基,于小培养瓶中培养。

    5.每日观察细胞生长情况,如果死细胞较多,复苏次日应换液。待细胞长满后可进行传代培养。

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