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碧波Caspase-3活性分光光度法检测试剂盒
  • 碧波Caspase-3活性分光光度法检测试剂盒
  • 碧波Caspase-3活性分光光度法检测试剂盒

    产品报价: 面议
    品  牌:biobox
    产品型号:BA3020/BA3050/BA30100
    所在地区:江苏
    (联系我时,请说明是在教育装备采购网上看到的,谢谢!)
    详细说明

    碧波Caspase-3活性分光光度法检测试剂盒

    一、产品简介
    Caspase 3 活性分光光度法检测试剂盒(Caspase 3 Activity Colorimetric Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性或纯化的Caspase 3酶活性的试剂盒。
    Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain,有时被写作caspase-3或caspase3,属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily),是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3可以剪切procaspase 2、6、7和9,并可以直接特异性剪切许多caspase 底物,包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase) , ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease),gelsolin和fodrin等。这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外,caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用,包括染色质固缩(chromatin condensention) ,DNA片段化(DNA fragmentation)等。同时caspase 3对细胞起泡(Cell blebbing)也起到关键作用。Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中,没有活性;但在细胞发生凋亡阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。
    Caspase-3分光光度法检测试剂盒就是将caspase-3序列特异性的多肽(Ac-DEVD-pNA (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)偶联至黄色基团:pNA (p-nitroaniline);当该底物被Caspase-3剪切后,黄色基团pNA即游离出来,
    可通过酶标仪或分光光度计(λ=405nm 或400nm)测定其吸光值,考察caspase-3的活化程度。pNA在405nm附近有强吸收。
    本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织caspase-3活性的检测。
    二、试剂盒组份
    组份 Cat:BB3020
    20 assays Cat:BB3050
    50 assays Cat:BB30100
    100 assays 储存条件
    裂解液 5.0 mL 10.0 mL 15.0 mL 4℃
    2×反应液 1.0 mL 2. 5 mL 5.0 mL 4℃
    Ac-DEVD-pNA 100μL 250μL 500μL -200C,避光
    DTT 50 μL 100 μL 150 μL -200C


    三、试剂盒以外自备仪器和试剂
    低温高速离心机、酶标仪或分光光度计(100μL的比色皿)、微量移液器、玻璃匀浆器(组织样本)
    1.5m L离心管、PBS、蛋白定量试剂及仪器
    四、保存条件:
    -20℃保存,Ac-DEVD-pNA需避光保存。
    五、注意事项:
    1、须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405,如有困难可以测定A400。
    2、Ac-DEVD-pNA需尽量避免反复冻融,请注意适当分装和避光保存。
    3、测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
    4、有文献报道少数类型的细胞凋亡检测不到caspase 3的激活。可能存在非依赖于Caspase-3活化的机制,这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-3活性无明显改变,需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
    5、本试剂盒的裂解液可以和碧波生产的其它Caspase活性检测试剂盒的裂解液通用,即本试剂盒裂解液制备的蛋白样品可以用于碧波其它Caspase活性检测试剂盒的检测。
    6、细胞数量需达到3~5×106个或新鲜组织100mg,以便能达到测定需要的100~200μg蛋白的要求,因为Caspase-3的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关,如测定的OD值偏低,可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。
    7、样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显,如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的,可以适当调节诱导细胞凋亡的时间,希望能找到一个caspase激活比较强的时间点,这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线,例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时,或0、1、2、4、8和16小时,或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。
    8、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
    六、操作规程
    1、 准备工作:
    a.、裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
    b、裂解液工作液的准备:使用前每50μL 裂解液加入0.5μL DTT
    c、2×反应液溶解后混匀并置于冰浴上备用
    2、 样品的处理
    a、对于悬浮细胞
    把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品,离心(2000rpm,5min)收集细胞,小心吸除上清,
    同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次。同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解30min,其间涡旋振荡3~4次,每次10 s;或冻融2~3次。下转第3步进行实验。
    b、对于贴壁细胞
    按常规的方法用胰酶消化贴壁细胞,并收集细胞。用PBS洗涤一次,吸尽上清后,按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解30min,其间涡旋振荡3~4次,每次10 s;或冻融2~3次。下转第3步进行实验。
    c、对于组织样品
    每50mg固体组织置于培养皿中,手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入50μL 冰冷裂解液工作液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中,冰浴再裂解5分钟。下转第3步进行实验。
    3、 4℃ 离心(12,000rpm, 10~15min)。
    4、 小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中,并放置冰上待用。
    5、 立即测定caspase 3的酶活性或-70℃保存样品,同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。如果细胞较小,可以适当增加细胞的用量。
    6、 Caspase 3酶活性的检测:
    a、 取出适量的Ac-DEVD-pNA 和2×反应液,置于冰浴上备用。
    b、 使用前每50μL 2×反应液加入0.5μL DTT。
    c、 吸取50μL含100~200μg蛋白的细胞或组织裂解上清;如体积不足50μL用裂解液补足至总体积50μL(各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较)。
    d、 如下设置反应体系:
    空白对照 样品
    2×反应液 50μL 50μL
    裂解液 50μL 0μL
    待测样品 0μL 50μL
    Ac-DEVD-pNA 5μL 5μL
    总体积 105μL 105μL

    e、 加入Ac-DEVD-pNA 后混匀,注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育4hr。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。
    f、 用酶标仪或分光光度计(100μL的比色皿)在λ=405nm或400nm测定其吸光值。
    g、 通过计算OD诱导剂/OD阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-3活化程度。
    7、 参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37℃可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3。说明:在本试剂盒的检测体系中,底物的起始浓度为0.2mM,此时底物是饱和的,对于许多样品而言在37℃孵育4个小时以内底物都是饱和的;对于样品中caspase 3酶活力特别高的情况,须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。

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