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碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(石蜡切片专用)
  • 碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(石蜡切片专用)
  • 碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(石蜡切片专用)

    产品报价: 面议
    产品型号:BA2120/BA2150/BA21100
    所在地区:江苏
    (联系我时,请说明是在教育装备采购网上看到的,谢谢!)
    详细说明
    碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(石蜡切片专用)

    一、产品简介
    TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品,经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤,即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
    细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP),随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合,最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
    本试剂盒适用于石蜡包埋组织样本的凋亡原位检测。
    本试剂盒有如下优点:
    1、 高灵敏度:可以在单细胞水平检测到细胞凋亡,同时由于凋亡早期就有DNA断裂,可以检测到早期的细胞凋亡。
    2、 操作简便:使用Ready-to-Use型试剂,并配有蛋白酶 K 和DAB。
    3、 特异性:TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞,而不容易标记坏死细胞。
    4、 快速:仅需约3个小时即可完成。
    5、 方便观察:使用光学显微镜观察实验结果,无需贵重设备。
    二、试剂盒组份
    组 份 Cat: BA2120 Cat: BA2150 Cat: BA21100 储存条件
    平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
    TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
    50×蛋白酶 K 40μL 100μL 200μL -20℃
    Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
    Biotin-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
    DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避光


    三、试剂盒以外自备仪器和试剂
    二甲苯、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液:苏木素或甲基绿等;
    盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。
    四、保存条件:
    -20℃保存,Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。
    五、注意事项:
    1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂,但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开,另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
    2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂,此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下,最好同时检测多个凋亡指标。
    3、使用前请认真阅读本说明书,提前准备好相关试剂。
    4、因本试剂盒中组分均为微量,使用前请离心。
    5、为避免试验误差、降低试剂的损耗,建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
    6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制,再分别滴加于各样本片上,避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
    7、DAB为固体粉末,使用前加入PBS配制成20×DAB(10 mg/ml)后,按说明书显色使用。
    8、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
    六、操作规程
    A、检测样本的预处理
    TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在,本说明书推荐的条件仅为普遍情况,用户需根椐自已的样
    本材料及首次试验结果来调整各个条件,如处理时间、处理浓度等,来优化出适合自身样本的试验条件,从而做出客观的试验结果。
    1、 对于常规石蜡切片
    a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
    (如:二甲苯脱蜡2次,每次5-10 min;乙醇水合(将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min))
    b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    c、 把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液, 21-37℃作用15-30min。
    (蛋白酶K工作液的配制:2μL 50×蛋白酶 K+98μL PBS)
    d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
    (封闭液的配制: 3%H2O2溶于甲醇)
    f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
    g、 然后转入B步骤标记和显色反应。
    注意事项:
    a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度,都因组织的类型不同而有所不同,需要自已摸索优化上述条件,如有问题,请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如:如果凋亡细胞染色较弱时,可用高浓度的蛋白酶K(400μg/mL)处理5分钟。(本试剂盒的50×蛋白酶K浓度为1mg/mL)。
    b、 其它替代方法:石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一,即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法,其余步聚均相同:
    替代方法1:
    将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min(通透液的配制:0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制)
    替代方法2:
    将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min(胃蛋白酶溶液的配制:0.25%-0.5%溶于HCl PH2;胰蛋白酶溶液的配制:0.25%-0.5%溶于0.01N HCl )
    替代方法3:
    将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中,置于微波炉中350W(低档)处理5 min。为防止样本脱落,请使用硅烷(Silane)处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
    c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。
    2、 对于难处理的石蜡切片
    a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
    (如:二甲苯脱蜡2次,每次5-10 min;乙醇水合(将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min))
    b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
    c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中,置于微波炉中750W(高档)处理1 min。
    d、 迅速加入80ml双蒸水(20-25℃)加入c步处理好切片的塑料盒中,冷却至室温,将组织切片转移至PBS(20-25℃)中。
    e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
    (封闭液的配制: 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清)
    f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次10min。
    g、 然后转入B步骤标记和显色反应。
    3、阳性对照及阴性对照的准备
    TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照,以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片,其后续步聚与待测样本同样进行。
    a、阳性对照样本的准备
    组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后,再加入100μL DNase I反应液(用户自备)室温—37℃处理10 -30 min,其余步骤均相同。
    (DNase I反应液的配制:10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)
    b、阴性对照样本的准备
    在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液,其余步骤均相同。
    B、 标记和显色反应:
    1、 预处理好的样本PBS漂洗2次,每次5min后,样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
    2、 配制TdT酶反应液:
    参考下表配制适当量的TdT酶反应液(根据需要按照比例放大),需充分混匀。注意:配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕,不能冻存。
    1个样品 5个样品 10个样品
    平衡液 45μl 225μl 450μl
    Biotin-dUTP 1μl 5μl 10μl
    TdT酶 4μl 20μl 40μl
    TdT酶反应液总体积 50μl 250μl 500μl

    3、 每个样本滴加50μL TdT酶反应液,加盖玻片37℃避光湿润反应60min。(阴性对照片不加TdT酶)
    4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    5、 Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制:
    Streptavidin-HRP工作液的配制:
    参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液,需充分混匀。注意:配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕,不宜冻存。
    1个样品 5个样品 10个样品
    Streptavidin-HRP 0.5μl 2.5μl 5μl
    PBS 99.5μl 497.5μl 995μl
    Streptavidin-HRP工作液总体积 100μl 500μl 1000μl

    DAB工作液的配制:
    a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20×DAB(10 mg/ml),配制方法如下:
    DAB 2mg 5mg 10mg
    PBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml
    配制成20×DAB(10 mg/ml),放于-20℃保存

    b、DAB工作液的配制:
    参考下表配制适量的DAB工作液,需充分混匀。注意:配制好的DAB工作液必须一次使用完毕,不宜冻存。
    1个样品 5个样品 10个样品
    20×DAB(10 mg/ml) 5μl 25μl 50μl
    30%H2O2 1μl 5μl 10μl
    PBS 94μl 470μl 940
    DAB工作液总体积 100μl 500μl 1000μl


    6、 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干,再滴加50μL Streptavidin-HRP工作液,加盖玻片37℃湿润避光反应30min。
    7、 把第6步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min,样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
    8、 将第7步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液,室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意:如果显色很强可以短于5分钟即停止显色,如果显色很弱,可以适当延长显色时间,甚至显色过夜。
    9、 把第8步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min,可直接光学显微镜下观察、拍照。
    10、选做(本步骤可不做):用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色后用光学显微镜下观察、拍照。
    具体的步骤请参照操作注意事项中的苏木素复染
    操作注意事项:
    1、 PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
    2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。
    3、 TdT酶反应液即用即配,短暂于冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。
    4、 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。
    5、 苏木素复染:将切片放入苏木素染液,染色----- 30min ,蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s,立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡-----5min。用二甲苯浸泡-----10min,更换二甲苯后再浸泡-----10min。晾干后在切片上加中性树胶,加盖玻片。

    七、常见问题的原因及推荐解决方案.
    现象 可能原因 建议

    非特异性染色 TdT酶的浓度过高 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释
    TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。 注意控制反应时间,并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。
    光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂) 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
    在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用) 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
    使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液 采用推荐的固定液
    固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭

    标记率低 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失) 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
    或福尔马林或戊二醛固定。
    固定时间过长,导致交联程度过高 减少固定时间,或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
    荧光淬灭 Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭,需注意避光操作

    促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 1、 增加通透剂促渗时间
    2、增加通透剂的作用温度(15-25℃)
    3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:以400ug/ml作用5min)
    4、0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。
    选择的染料不合适 用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基绿PH4.0,或苏木素复染
    染色背景很高 支原体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染
    TdT酶的浓度过高或反应时间过长 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间
    红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
    高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。 在非高增殖期取样检测
    DAB孵育时间过长 减少DAB染色时间
    Biotin-dUTP的非特异性结合 在TdT酶反应之后,再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
    阳性对照没有信号 DNase I的浓度过低 1、 冷冻切片使用3u/ml的DNase I
    2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I
    3、 一般样本使用10u/ml DNase I
    组织样本从载玻片脱落 组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶K的处理时间
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