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碧波一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用型)
  • 碧波一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用型)
  • 碧波一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用型)

    产品报价: 面议
    品  牌:biobox
    产品型号:BA2420/BA2450/BA24100
    所在地区:江苏
    (联系我时,请说明是在教育装备采购网上看到的,谢谢!)
    详细说明
    碧波一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用型,适用于细胞、组织样本)

    一、产品简介
    一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简
    便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织,只要经过一步染色反应,洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。
    细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP),从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
    本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)的凋亡原位检测。
    本试剂盒有如下优点:
    1、高灵敏度:可以在单细胞水平检测到细胞凋亡,同时由于凋亡早期就有DNA断裂,可以检测到早期的细胞凋亡。
    2、特异性:TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞,而不容易标记坏死细胞。
    3、快速:仅需约1-2个小时即可完成。
    4、操作简单:只需一步染色反应,洗涤后即可观察,不必使用二抗等进行多步操作。
    5、应用范围广:可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
    二、试剂盒组份
    组 份 Cat: BA2420 Cat: BA2450 Cat: BA24100 储存条件
    平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
    荧光标记液 20μL 50μL 100μL -20℃避光
    TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
    50×蛋白酶 K 40μL 100μL 200μL -20℃




    三、试剂盒以外自备仪器和试剂
    二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸、荧光显微镜
    四、保存条件:
    -20℃保存,荧光标记液需避光保存。
    五、注意事项:
    1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂,但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开,另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
    2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂,此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下,最好同时检测多个凋亡指标。
    3、使用前请认真阅读本说明书,提前准备好相关试剂。
    4、因本试剂盒中组分均为微量,使用前请离心。
    5、为避免试验误差、降低试剂的损耗,建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
    6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制,再分别滴加于各样本片上,避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
    7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
    六、操作规程
    A、检测样本的预处理
    TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在,本说明书推荐的条件仅为普遍情况,用户需根椐自已的样
    本材料及首次试验结果来调整各个条件,如处理时间、处理浓度等,来优化出适合自身样本的试验条件,从而做出客观的试验结果。
    1、 对于细胞样本
    a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。
    b、 把晾干的样本浸入固定液,室温(15-25℃)固定15-60min。
    (固定液的配制:4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中,需新鲜配制)
    c、 把固定好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    d、 把c步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
    (封闭液的配制: 3%H2O2溶于无水甲醇)
    e、 把d步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    f、 把e步处理好的样本浸入通透液中,冰上(2-8℃)促渗2min。
    (通透液的配制:0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制)
    g、 然后转入B步骤标记反应。
    注意事项:
    a、 为防止样本脱落,请使用硅烷(Silane)处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
    b、 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟~一晚,以改善细胞的渗透性。
    c、 使用PBS漂洗细胞样本时,不要直接加在细胞样本上,以防止细胞样本的脱落。
    d、 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备,请按上述方法配制。
    2、 对于石蜡切片
    a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
    (如:二甲苯脱蜡2次,每次5-10 min;乙醇水合(将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min))
    b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    c、 把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液, 21-37℃作用15-30min。
    (蛋白酶K工作液的配制:2μL 50×蛋白酶 K+98μL PBS)
    d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
    (封闭液的配制: 3%H2O2溶于甲醇)
    f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
    g、 然后转入B步骤标记反应。
    注意事项:
    a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度,都因组织的类型不同而有所不同,需要自已摸索优化上述条件,如有问题,请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如:如果凋亡细胞染色较弱时,可用高浓度的Proteinase K(400μg/mL)处理5分钟。(本试剂盒的50×Proteinase K浓度为1mg/mL)。
    b、 其它替代方法:石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一,即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法,其余步聚均相同:
    替代方法1:
    将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min(通透液的配制:0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制)
    替代方法2:
    将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min(胃蛋白酶溶液的配制:0.25%-0.5%溶于HCl PH2;胰蛋白酶溶液的配制:0.25%-0.5%溶于0.01N HCl )
    替代方法3:
    将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中,置于微波炉中350W(低档)处理5 min。为防止样本脱落,请使用硅烷(Silane)处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
    c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。
    3、 对于冷冻切片
    a、 把冰冻切片浸入固定液,室温(15-25℃)固定30min。
    (固定液的配制:4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中,需新鲜配制)
    b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次15min。
    c、 把b步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
    (封闭液的配制: 3%H2O2溶于甲醇)
    d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
    e、 把d步处理好的样本浸入通透液中,冰上(2-8℃)促渗2min
    (通透液的配制:0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制)
    f、 然后转入B步骤标记反应。
    4、对于难处理的切片
    a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合
    (如:二甲苯脱蜡2次,每次5-10 min;乙醇水合(将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min))
    b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次5min。
    c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中,置于微波炉中750W(高档)处理1 min
    d、 迅速加入80ml双蒸水(20-25℃)加入c步处理好切片的塑料盒中,冷却至室温,将组织切片转移至PBS(20-25℃)中。
    e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
    (封闭液的配制: 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清)
    f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次,每次10min。
    g、 然后转入B步骤标记反应。
    5、阳性对照及阴性对照的准备
    TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照,以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片,其后续步聚与待测样本同样进行。
    a、阳性对照样本的准备
    组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后,细胞样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后,再加入100μL DNase I反应液(用户自备)室温—37℃处理10 -30 min,其余步骤均相同。
    (DNase I反应液的配制:10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)
    b、阴性对照样本的准备
    在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液,其余步骤均相同。
    B、 标记反应:
    1、 预处理好的样本PBS漂洗2次,每次5min后,样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
    2、 配制TdT酶反应液:
    参考下表配制适当量的TdT酶反应液(根据需要按照比例放大),需充分混匀。注意:配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕,不能冻存。
    1个样品 5个样品 10个样品
    平衡液 45μl 225μl 450μl
    荧光标记液 1μl 5μl 10μl
    TdT酶 4μl 20μl 40μl
    TdT酶反应液总体积 50μl 250μl 500μl

    3、 每个样本滴加50μL TdT酶反应液,加盖玻片37℃避光湿润反应60min。(阴性对照片不加TdT酶)
    4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
    5、 荧光显微镜下观察,可以使用的激发波长范围为450-500nm,发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
    操作注意事项:
    1、 PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。
    2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。
    3、 TdT酶反应液即用即配,短暂于冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。

    七、常见问题的原因及推荐解决方案
    现象 可能原因 建议

    非特异性染色 TdT酶的浓度过高 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释
    TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。 注意控制反应时间,并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。
    光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂) 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
    在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用) 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
    使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液 采用推荐的固定液
    固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭

    标记率低 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失) 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
    或福尔马林或戊二醛固定。
    固定时间过长,导致交联程度过高 减少固定时间,或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
    荧光淬灭 Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭,需注意避光操作

    促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 1、 增加通透剂促渗时间
    2、增加通透剂的作用温度(15-25℃)
    3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:以400ug/ml作用5min)
    4、0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。
    荧光背景很高 支原体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染
    TdT酶的浓度过高或反应时间过长 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间
    红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
    高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
    阳性对照没有信号 DNase I的浓度过低 1、 冷冻切片使用3u/ml的DNase I
    2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I
    3、 一般样本使用10u/ml DNase I
    组织样本从载玻片脱落 组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶K的处理时间
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