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 TUNEL原位检测试剂盒(冰冻切片)(FITC标记POD法
  • TUNEL原位检测试剂盒(冰冻切片)(FITC标记POD法
  • TUNEL原位检测试剂盒(冰冻切片)(FITC标记POD法

    参考价格: ¥0.00
    产品型号:KGA7026,7036,7046
    所在地区:江苏
    上架时间:2012年09月21日
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    详细说明

    TUNEL原位检测试剂盒(冰冻切片)(FITC标记POD法
    TUNEL原位检测试剂盒(冰冻切片)(FITC标记POD法)(TdT酶介导的原位末端标记dUTP检测试剂盒)(DNA片段化检测试剂盒)

    Cat numberKGA      
    Store at-20 for one year
    Expire date
    For Research Use Only
    凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
    FITC标记POD,冰冻切片专用
    使用说明书
    Cat:KGA7026,7036,7046 20,50,100Tests
     
    一、 TUNEL检测原理    ................................................................................ ..2
    二、试剂盒组分         .....................................................................................3
    三、检测样本的预处理
       1冰冻切片样本的预处理.   ........................................................................4
    2阳性对照及阴性对照的准备 ......................................................................5
    四、 标记及显色反应            ......................................................................6
    五、 常见问题的原因及推荐解决方案 ..............................................................8
    一、TUNEL试剂盒说明
    凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC标记POD法)是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3-OH末端,可用荧光显微镜检测;荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记,,在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下,产生很强的颜色反应(呈棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被标记或染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡切片)的凋亡原位检测。
    本试剂盒特点
    操作简便:使用Ready-to-Use型试剂,并配有Proteinase K和DAB。
    高灵敏度:可以单一检出初期的凋亡细胞。
    高特异性:能特异性染色凋亡细胞。
    快速操作:整体操作约需3小时。
    方便观察:可使用荧光显微镜观察实验结果,亦可在信号转换后使用光学显微镜观察实验结果。
    高正确性:有阳性对照片的制备方法,可以确认试剂盒的有效性
    二、TUNEL试剂盒组分
    组   份
    Cat: KGA-7025
    20 assays
    Cat: KGA-7035
    50 assays
    Cat: KGA-7045
    100 assays
    储存条件
    Equilibration Buffer
    1.0 mL
    2.5 mL
    5.0 mL
    -20℃
    FITC-12-dUTP
    20μL
    50μL
    100μL
    -20℃
    TdT Enzyme
    80μL
    200μL
    400μL
    -20℃
    anti-fluorescein antibody
    200μL
    500μL
    1000μL
    -20℃
    DAB
    2mg
    5mg
    10 mg
    -20℃
    *注:因DAB为固体粉末,使用前加入适量PBS溶解,配制成20×DAB(10 mg/ml)后,按下述方法显色使用。
    注意事项
     
    1使用前请认真阅读本说明书,提前准备好相关试剂。
    2因本试剂盒中组分均为微量,使用前请离心集液。
    3为避免试验误差、降低试剂的损耗,建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
    4TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制,再分别滴加于各样本片上,避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
    5. 用户自备:多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染苏木素染液盖玻片、载玻片、染色缸。
    三、检测样本的预处理
    TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在,本说明书推荐的条件仅为普遍情况,用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件(参照Page 7),如处理时间、处理浓度等,来优化出适合自身样本的试验条件,从而做出客观的试验结果。
    1. 冰冻切片的预处理
    2. 阳性对照及阴性对照的准备
    TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照,以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片,其后续步骤与待测样本同样进行。
     A阳性对照样本的准备
      组织样本(冰冻切片)在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后,再加入100μL DNase I反应液(冰冻切片:2000-3000U DNase I;细胞:1000-2000U DNase I;石蜡切片 3000-5000U DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)(用户自备)室温~37处理10~30 min,其余步骤均相同。如有问题详见Page 7.
    B阴性对照样本的准备
    在Page6标记反应制备TdT酶反应液时,不添加TdT酶,其余步骤均相同。
    四、标记和显色反应
    操作注意事项:
    1. 进行PBS清洗时,以5分钟清洗3次为标准。
    2. PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应
    3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。
    4. TdT酶反应液即用即配,短暂于冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。
    5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。
    6.苏木素复染:将切片放入苏木素染液,染色­­­­­ 30s-10min(根据样本做适当调整),蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s,立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡­­­­­5分钟。用二甲苯浸泡­­­­­10分钟,更换二甲苯后再浸泡­­­­­10分钟。晾干后在切片上加中性树胶,加盖玻片。
    现象
    可能原因
    建议
    非特异性染色(例如:非凋亡细胞的强染色)
    Biotin-dUTP的非特异性结合
    勿使细胞干涸
    在TdT酶反应之后,再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
    TdT酶的浓度过高
    用TdT dilution buffer* 作1:2—1:10稀释
    内源过氧化物酶未被封闭
    封闭液室温(15-25℃)封闭10min(封闭液: 3%H2O2溶于甲醇)
    光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂)
    尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂
    在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用)
    确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定
    固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂
    用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭
    染色背景较高
    福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色
    尝试以甲醇固定,但可能会降低检测的敏感性。
    内源过氧化物酶未被封闭
    封闭液室温(15-25℃)封闭10min(封闭液: 3%H2O2溶于甲醇)
    Biotin-dUTP的非特异性结合
    在TdT酶反应之后,再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
    样本被支原体污染
    使用支原体检测试剂盒检测,如阳性则制备未被污染的新样本
    标记反应试剂(TdT酶及dUTP)的浓度过高
    稀释50%,以降低标记反应的浓度
    细胞处于高度增殖期
    在非高增殖期取样检测
    DAB孵育时间过长
    减少DAB染色时间
    标记率低、染色淡至无
    如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)
    用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定
    或福尔马林或戊二醛固定。
    过度的固定导致与蛋白过度交联
    缩短固定时间,或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
    促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低
    l       增加通透剂促渗时间
    l       增加通透剂的作用温度(15-25℃)
    l       优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:以400ug/ml作用5min)