分光光度法Spectrophotometry
基本原理
光线是高速运动的光子流，也是具有波长和频率特征的电磁波。光子的能量与频率成正比，与波长成反比。肉眼可见的光线称为可见光。可见光只占电磁波谱的很窄部分(400nm 到760nm)。不同波长的可见光具有不同的颜色。波长大于760nm 的光线称为红外线。波长小于400nm的光线称为紫外线。
当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线，选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。例如核黄素之所以呈现黄色，是由于它仅吸收可见光中的蓝光范围，并测得其吸收峰在450nm(图2-1)。在紫外光范围它还有两个吸收峰。它们分别是260nm和370nm。
分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。
(一)郎伯定律(Lambert’s Law)
一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著(图2-2)
若 I0表示入射光强度，I表示光线通过溶液后的强度，L 表示溶液的厚度。
(二)比尔定律(Beer’s Law)
当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度减弱也愈显著，与上定律相似。两者的关系可以表示如下：
其中，C表示溶液的浓度。K2是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液厚度的影响。上述公式所表示的光强度与溶液浓度的关系称为比尔定律。虽然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比尔定律。这是由于有些物质在不同浓度条件下其颜色可能发生改变，即在不同浓度条件下其吸收光的波长发生改变。常见的原因如下：
1.有些有色物质在溶液中可能解离成相应的离子，离子的颜色与分子的颜色不同，造成对比尔定律的误差。
2.有些物质在较高浓度状态下可形成络合物，络合物使吸收光谱发生改变。例如：氯化钴在稀溶液中呈玫瑰色，而在浓溶液中呈蓝色。
3.氢离子浓度和电解质也可引起一些有色物质颜色的改变，这些改变也可能造成比尔定律的误差。
(三)郎伯——比尔定律及其应用
一般将通过溶液后的光线强度(I)和入射光(Io)的比值称为透光度(transmittance,T)，将-Log 用吸光度(absorbance, A)表示，以反映该溶液对光吸收的情况。有时也用吸光度(Optical density, O.D.)表示。则它们之间的关系如下
其中，E为消光系数(Extinction coefficient), 表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。
从公式(1)可知对于相同物质和相同波长的单色光(消光系数不变)来说，溶液的吸光度和溶液的浓度呈正比。
如果C2为标准溶液的浓度，则可根据测得的吸光度值，按公式(2)求得待测溶液的浓度。
实际工作中为简便起见，常常不是每测一个待测样品都做一个标准管，而是事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以吸光度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质的吸光度后，便可从标准曲线上查到相应的浓度数值。
从公式(1)可知，若知道某待测物质的消光系数和溶液的厚度，也可以从吸光度推算出待测溶液的浓度。消光系数的常用表示方法有二：
1.百分消光系数(E1%1cm);浓度以百分浓度来表示的消光系数。百分消光系数等于浓度为1%，液层厚度为1cm 的吸光度值。
2.克分子消光系数(ε);浓度以摩尔浓度来表示的消光系数。克分子消光系数等于溶液浓度为1个摩尔浓度，液层厚度为1cm的吸光度值。
用消光系数计算浓度的公式是：
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