100余位关心质谱技术的专家参加首届质谱论坛学术报道

　　在2010年10月15日召开的首届质谱论坛(首届质谱论坛召开质谱中心三年庆典)上，共有四位教授、专家做了学术报告，100余位关心质谱技术的专家、学生和几位报告人一起，分享了精彩的报告。

　　布鲁克道尔顿公司的应用经理张欣怡博士首先做了题为“蛋白质组学与生物质谱”的报告。在报告中，张博士首先回顾了该学科和技术在过去几十年里的发展，指出在以下三方面获得飞速发展，使质谱成为蛋白质组学研究不可缺少的工具。这三方面包括：MALDI/ESI发明后的质谱技术、计算机技术在存贮容量和速度方面的进步、以及基因组测序方面的革新。她指出：随着蛋白质组学研究的深入发展，对质谱提出愈来愈高的要求;而蛋白质组学的发展，又促进了生物质谱技术的不断提高。目前认为，蛋白质组学研究需要两条路线，一条路线基于MALDI路线，一条基于ESI液质联用技术。布鲁克道尔顿公司为蛋白质组学研究提供了完整多样化的解决方案和业界领先的新技术与专利，比如：ultrafleXreme MALDI TOF/TOF，micrOTOF-Q II，maXis Q-TOF，离子阱等技术。

　　布鲁克道尔顿公司的应用经理张欣怡博士：蛋白质组学与生物质谱

　　接下来张博士先主要介绍了其MALDI技术路线包括：2D胶-MALDI TOF/TOF;LC-MALDI TOF/TOF;液体芯片-MALDI TOF：医学蛋白质组学ClinProt;MALDI分子成像;微生物的鉴别与分类：MALDI Biotyper;MALDI-TDS(Top-Down Sequencing)自上而下的蛋白末端序列分析等。

　　张博士举了一个例子，用MALDI分子成像技术来发现和监测组织中的生物标志物，该实例主要来区分乳腺癌组织为HER2阳性还是HER2阴性癌变。该方法的流程为：1)导电玻璃片固定组织冷冻切片;2)组织切片表面喷以基质;3)MALDI TOF质谱仪测定;4)运用flexImaging分子成像软件来监测和ClinProtTools软件来鉴定样本间的差异。布鲁克道尔顿公司提供性能可靠、独一无二的硬件组合，包括：Imageprep基质喷雾仪、导电载玻片、样品靶体、Smartbeam激光、以及高性能MALDI TOF/TOF质谱仪。该方法和结果发表在J. Proteome Research期刊上(2010,9, 1854-1863)。

　　张博士介绍的另一个例子是用MALDI Biotyper来进行微生物的快速鉴别与分类。布鲁克道尔顿公司建立了强大丰富的微生物数据库，应用简单、快速、高通量、高准确度的方法(MALDI Biotyper技术)来获得微生物蛋白质特征指纹谱，从而鉴定微生物。在全球利用该技术来鉴定微生物的实验室有200家，中国疾病控制中心也购置了该系统。布鲁克道尔顿公司在该技术上占有全球绝对领先的地位。

　　在ESI技术上，布鲁克道尔顿公司拥有高分辨、高质量精度的质谱技术和强大的软件工具Biotools，可以开展许多尖端的研究如：DeNovo Sequence未知多肽从头测序;翻译后修饰鉴定;定量蛋白质组学。在翻译后修饰鉴定方面，举例了在鲨鱼脑组织研究中，鉴定的多肽链硫酸化、磷酸化修饰、N-端乙酰化修饰等，并可利用高分辨来区分蛋白质甲基化的假阳性。在定量蛋白质组学方面，布鲁克道尔顿公司可提供非标记(ProteomeQuant Workflow)、标记(利用DIGE、SILAC、ICPL等技术)两种工作流程。

　　在ESI技术上，布鲁克道尔顿公司还提供amaZon离子阱技术，配合使用ETD(电子转移解离)技术，在翻译后修饰、深入蛋白质研究方面具有更多独特的优势。

　　中国科学院北京基因组研究所刘斯奇研究员做了题为“Protein biomarkers in clinical assay using mass spectrometry: possibility and difficulties”(使用质谱技术发现临床医学中蛋白生物标志物：可能性和难点)的报告。刘研究员首先以非常吸引人的开头介绍了两届Nobel奖获得者Frederick S. Sanger教授曾经写下的话。Sanger教授一生只写过三篇文章，拿了两个Nobel奖，第一个奖是Insulin的测序，第二个是DNA的测序。Sanger教授在1958年曾表达了希望有一天可以做到蛋白质完全测定和测序，所以，刘教授开篇引用Sanger教授的话，即指出了蛋白质研究的重要性。蛋白质带有的信息丰富，在不同时间、空间点上表达的状态是不同的，有不同的修饰和相互作用，蛋白质组分析是现今所有其它核酸分析等技术所无法取代的。蛋白质生物标志物的测定有很多特点，比如可直接从生物体液中取样，和疾病的状态联系更紧密。对于蛋白质生物标志物来说，是1984年Nobel奖获得者的发现，三位科学家发现了单克隆抗体，创造了以抗体为基础进行生物标志物鉴定的一个时代，现在已广泛地应用于医院临床。

　　中国科学院北京基因组研究所刘斯奇研究员：Protein biomarkers in clinical assay using mass spectrometry: possibility and difficulties(使用质谱技术发现临床医学中蛋白生物标志物：可能性和难点)

　　这种以抗体为基础的方法(如ELISA)有很多优点，比如：特异性强、高通量、容易使用和测定等。但这种方法也存在一些问题，比如：它认为一个疾病和一个抗体相关，而其实疾病常常是多个蛋白共同作用的结果。另外不同产地、不同个体间、不同特性的差异，如果要做多个蛋白、多个抗体的实验设计，就使不同实验室测定的结果很难保持一致。同时抗体这种方法的开发应用到临床又是非常漫长和高花费的，比如发展一个临床方法需要花费10万美元以上。从FDA批准的基于抗体的方法，从1977 ~ 1993年批准了87个，平均每年批准5.8个;而在1994 ~ 2009年近15年来只批准了22个，平均每年批准仅1.5个，最近几年基本没有。这说明一个新技术刚出现时发现很多;而过了一段时间，发现会变得缓慢，也会进一步呼唤新技术的出现。这时，蛋白质组学应运而生，而蛋白质组学自诞生之日起，世界各国的期待都是发现跟疾病相关的生物标志物，包括中国第一个支持的项目就是疾病蛋白质组。可十年来，还没有一例用蛋白质组发现的生物标志物用于临床上，这时会有一些人来质疑。刘教授下面即开始解释这些科学的难点，并为我们描述未来的方向。

　　从ESI和MALDI的发明开始，质谱技术开始越来越广泛地应用到生物领域。几个月前一位著名的专栏作家Peter Mitchell. 在Nature Biotech(2010, 28:665-670)上发表题为“Proteomics retrenches”的综述文章，提出今后几年蛋白质组发展必须要走的几种方向。主要就是要使蛋白质组发现成为可重现的，走向定量蛋白质组学。所以，定量蛋白质组学技术变得非常迫切，并要回答技术上是否可行的问题。不久前悉尼举办了HUPO会议，主要的主题就是：是否能在大规模蛋白质组的研究中，能够提供定量的蛋白质组学数据。另外，Matthias Mann不久前在PNAS(2008, 105:18132-18138)上提出了精度蛋白质组(Precision proteomics)的概念，强调了高分辨和高质量准确度的技术。

　　至今，蛋白质组学的发展有两大方向：从定性到定量，从发现到目标物分析(From discovery to target)。这里不得提到美国NCI(国家癌症研究中心)从2006年开展的一个项目，这个项目由NCRI设计实验，分配给美国8家顶尖实验室来进行，主要是通过比对实验来考察和确立目标蛋白质组学分析方法是否可行。该实验选择了9个跟疾病相关的蛋白质，并合成了标准的多肽，分为三个流程分配给8家实验室，让实验室任意选用仪器和方法来测定。整个实验分为三个过程，从简单到复杂。最近NCI把结果发表在Nature Biotech(2009; 27:633-41)上，比较了Interlab和Intralab之间的数据比对结果。发现表明，目前有些实验可以满足偏差< 15%，而在应用于血浆样品时会有< 25%的较大偏差，这跟不同实验室如何对血浆进行前处理非常相关，NCI就此也提出了一系列的前处理策略。在定量策略上，NCI也提出要在全球建立基于MRM的蛋白质组学定量方法和数据库。另外，从世界著名的蛋白质组学权威学术专家Ruedi Aebersold教授的实践来看，他表示当前各个厂家获得的MRM结果是类似的，所以在全球范围建立基于MRM定量的蛋白质组数据库方法是可行的。

　　中国医学科学院基础医学研究所的李智立教授做了题为“傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR MS)在生物医学中的应用”的报告。李教授首先指出，当前在用质谱来研究蛋白质组学、鉴定蛋白质方面，我们很多时候还处于“瞎子摸象”的阶段，因为很多时候不知道到底测定的是细胞、组织中的哪个蛋白，即唯一性不够。这是为什么呢?李教授列举了分子量在399左右的一系列分子及其分子式，它们的分子量差别仅在ppb级别;除了分子量的微小差别，这几个化合物的同位素分布也有极其微小的差别。这要求我们进一步去了解质谱的结构和原理。在简要地介绍了质谱原理后，李教授介绍了其实验室的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR MS)，并列举了近一年来他在其上做出的工作。

　　中国医学科学院基础医学研究所的李智立教授：傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR MS)在生物医学中的应用

　　在应用上，FTICR MS可应用于生物大分子，做蛋白质鉴定、蛋白质翻译后修饰位点鉴定、复杂蛋白质混合物的分离分析、蛋白质突变点分析、蛋白质精确分子量测定等挑战性极高的工作。李教授介绍了一系列发表在PNAS、AC、JASMS、COB等期刊上的实例，来介绍FTICR MS在生物大分子方面的工作，FT ICRMS可以获得更精细的、更确定的结果。比如：磷酸化位点的鉴定和确认(PNAS 2006：103：3094-3099)，二硫键的定位及确认(AC. 2009 p. 7611)，蛋白质混合物的鉴定(JASMS. 2009)，蛋白质混合物分子量的精确测定，代谢物分析(COB, 2010. p35)，血清中小分子的代谢物分析(Metabolomics. 2008. p126)，鼠脑组织的组织成像(JASMS 2007. 145)等。李教授还介绍了组织成像实验需要注意的事项，比如要考虑样本处理方法的影响，样本自身变化的影响，仪器的选择和仪器性能的影响等。

　　北京师范大学生命学院的何大澄教授做了题为“让质谱结合跟上蛋白组学研究的动态——SiLAD技术及其在细胞周期研究中的应用”的报告。何教授首先向大家介绍了前几天的香山会议，科学家们一起讨论了蛋白质组学的挑战和机遇。现代的蛋白质组学已经称为“基于质谱的蛋白质组学”，可见质谱在蛋白质组学中的作用是多么重要。

　　北京师范大学生命学院的何大澄教授：让质谱结合跟上蛋白组学研究的动态——SiLAD技术及其在细胞周期研究中的应用

　　接下来，何教授从蛋白质组学的基本使命谈起，指出动态和体内是蛋白质组的灵魂。目前的方法都是比较蛋白质在不同时间点的存在量，难以检测出微细的变化和进出的状态，灵敏度和通量的不足都在实际上制约了时间分辨率和造成对一些动态变化的掩盖。因此，何教授课题组提出了创新的SiLAD动态蛋白质组技术，SiLAD是一种35S体内标记的动态蛋白质组学分析技术，该技术首先用35S体内脉冲标记样本，脉冲标记15min(最短8min)，35S 完全不影响细胞正常的代谢/合成，只有在很短的时间(几分钟)内合成的蛋白被标记;接着把带有标志的蛋白取出来用双向电泳分离、进行CBB(Coomassie blue ，考马斯亮蓝)染色并用Phospho-image高速获得图像;观察差异蛋白2DE谱;将观察到的发生明显功能性变化的蛋白转移出来进行MS/MS鉴定。这样就得到了真正的差异表达蛋白，差异在表达活性上。SiLAD技术具有如下优点：可先排除已存在蛋白质的干扰，大大提高表达差异筛选的敏感性;可显示15min内所研究蛋白表达的平均速度，显著提高试剂分辨率并更直接地反映相关细胞活性;具有高通量能力，可同时检测大量差异表达蛋白;不影响蛋白质的鉴定。

　　何教授通过血清饥饿培养细胞(serum starved cultured cell)和鼠肝切除术(Rat Liver Hepatectomy)两个模型说明SiLAD在G0(即增殖暂时休止期)/G1转变中的应用。SiLAD技术反映了蛋白质生成的速度和时间的关系曲线，更直接地反映了细胞生命周期活动的不同动态类型。

　　该研究成果阐明了一定条件下，G0期细胞重新进入细胞周期的整个过程。比如在大鼠体内肝脏切除的研究中，肝脏细胞一般处在G0期，部分肝切除后，细胞重新进入增殖周期。深入了解这一过程的机理，对肿瘤防治(肿瘤可以视为细胞周期病，如使之停留在G0期，肿瘤就无害了)以及干细胞的研究和应用(主要任务就是如何让干细胞扩增，然后再诱导定向分化)均有重要意义。

　　最后，何教授总结：许多现行传统技术获得的差异蛋白分析结果在采用SiLAD技术后会被改写!比如，更关注的将不再是某种蛋白总量变化的多少，而是某种蛋白发生变化的动力学，是变化的速率。

　　报告会后，进行了兴奋的互动抽奖活动，北京师范大学生命学院的何大澄教授、布鲁克道尔顿公司大中华区总经理王洪琦先生、布鲁克道尔顿公司的维修部经理马龙华先生、北京师范大学分析测试中心李崧主任分别上台，抽出了当日的幸运奖品。他们分别获得了双肩背包和精美茶具。