小儿眼病的病情准确诊断与监测一直是临床上的一大难题，往往需要通过临床症状来评判。因此，小儿眼病的诊断评估急需新的分子诊断技术的帮助。房水是眼球眼房中，介于角膜和晶状体之间的无色透明水样液体，主要作用为屈光、为眼内组织提供营养和氧气、排出其代谢产物和维持眼内压。使用前房穿刺术可以安全地取出房水，作为液体活检样本用于诊断和监测眼病。
研究表明，外泌体在视觉系统中可能有重要作用，如外泌体与青光眼和黄斑变性的病理生理相关。由于血-视网膜屏障存在，房水中的外泌体主要由眼内组织分泌，使得外泌体在眼病研究中更具有针对性。先前的研究中并未涉及房水外泌体的来源与分布，且由于技术手段的限制，至今尚未将房水外泌体与小儿眼病联系起来。
基于以上研究成果与客观需要，研究组获取了患有不同眼病，包含先天性白内障（CAT），先天性青光眼（GLC），小儿视网膜疾病（PRD）和视网膜母细胞瘤（Rb）的19个不同患者的房水样本，再将Rb患者根据治疗情况分为经过初步治疗（诊断+初步切除）（Rb_Tn）和经过主动治疗（二次切除+化疗）（Rb_Tx）两组，使用全自动外泌体荧光检测分析系统 ExoView的配套芯片，通过抗原抗体结合捕获了房水中的特异性外泌体，无需纯化，直接检测了房水中存在的不同亚群的外泌体的含量。
在非肿瘤眼病（CAT+GLC+PRD）和Rb_Tx组中，CD63+外泌体数量显著高于其他表型，表明房水CD63+外泌体占大多数（图1c）。Rb_Tn组的外泌体数量要高于Rb_Tx，说明在化疗前房水中可能含有大量肿瘤分泌的外泌体（图1d）。
图1 ExoView检测不同患者样本的外泌体跨膜蛋白的表达。
（a）不同眼病样本的外泌体荧光图像（红色：CD63；绿色CD81；蓝色：CD9）；（b）不同患者样本经过IgG阴性对照标准化的荧光颗粒计数表；（c）（d）不同组别样本经过IgG阴性对照标准化的荧光颗粒计数的柱形图。
对不同组别的各个外泌体亚群进行统计分析发现，非肿瘤眼病（CAT+GLC+PRD）和Rb_Tx组中，仅表达CD63的外泌体数量多，Rb_Tn组的亚群则更加多样化（图2b&图2c）； CAT/GLC/PRD/Rb_Tx组中CD63+外泌体在CD63捕获位点中比例高（图2d&图2e），而在Rb_Tn组的比例则显著小于其他组，但CD9+/CD63+，CD63+/CD81+和CD9+/CD63+/CD81+则相对更多（图2f）。以上结果说明，仅表达CD63的外泌体是房水中所特有的，Rb_Tn组的其他亚群则与肿瘤相关，肿瘤的治疗改变了外泌体的亚群组成比例。
图2 ExoView检测不同组别样本的外泌体跨膜蛋白的共定位
（a）荧光图像示例（红色：CD63；绿色CD81；蓝色：CD9）；（b）（c）不同组别的各个外泌体亚群数量；（d）（e）（f）不同组别的各个外泌体亚群比例。
为确认ExoView芯片捕获的是膜结构完整的外泌体，研究人员将两份样本经Triton-X 100处理破坏外泌体膜结构后，再使用ExoView检测。与未经处理的样本对比，荧光颗粒计数有显著下降，证明实验检测到的外泌体是脂双层结构完整的外泌体（图3）。
图3 Triton-X100处理过的房水样品的跨膜蛋白表达。
在人的其他体液，如血浆和淋巴液中，CD63+外泌体占比仅为≤10%，而房水中CD63+外泌体的含量很高，说明CD63+外泌体可能是房水特有的。有研究表明，鼠视网膜色素上皮分泌的CD63+外泌体参与了巨噬细胞的细胞间通信。因此，CD63+外泌体可能与眼部的免疫调节相关。Rb患者房水中表型更加多样化的外泌体来源可能是肿瘤细胞；经治疗后，CD63+外泌体比例上升，说明眼部趋向正常，因此，CD63+外泌体，以及肿瘤相关外泌体亚群的含量有作为肿瘤病情监测指标的潜力。在今后的研究中，使用ExoView检测含有更多种蛋白标志物和内容物的外泌体，可以检测并识别更多疾病相关的蛋白标志物和内容物，助力小儿眼病的诊断和治疗。
本研究中，科学家借助美国NanoView Biosciences公司研发的全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，直接检测病人样本中微量的外泌体，无需纯化，操作简单。一次结果直接输出外泌体粒径，绝对数目，蛋白表型，不同亚群的含量。多角度全方位的佐证了外泌体或可作为液体活检样本用于诊断和监测眼病。也说明了ExoView的无需纯化，全面表征的特点是临床液体活检，尤其是微量检测的一大利器。
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【参考文献】
[1] Peng, C. C., Im, D., Sirivolu, S., Reiser, B., Nagiel, A., Neviani, P., ... & Berry, J. L. (2022). Single vesicle analysis of aqueous humor in pediatric ocular diseases reveals eye specific CD63‐dominant subpopulations. Journal of Extracellular Biology, 1(4), e36.
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