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仪器介绍：
智能全控高效液相色谱系统LC-100plus等度配置
目的采用高效液相色谱法对小蓟中芦丁成分进行定量。方法采用LichrospherC18色谱柱(4.6mm×200mm,5μm),柱温30℃,甲醇-0.5%醋酸(体积比为35∶65)为流动相,流速1.0mL/min,检测波长254nm。结果小蓟中芦丁的含量为0.5808mg/g。结论经过系统的方法学考察,该方法具有简便、专属、稳定、可重复的特点,可用于小蓟中芦丁的含量测定。
小蓟为菊科植物小蓟[Cirsiumsetosum(Willd.)MB.]的干燥地上部分或根,具有凉血止血、祛瘀消肿的功能,可用于治疗衄血、吐血、尿血、便血、崩漏、外伤出血、痈肿疮毒等。小蓟中所含有机酸中有芦丁、咖啡酸等,文献记载芦丁、咖啡酸为其止血活性成分。本实验采用高效液相色谱法测定小蓟中芦丁的含量,方法稳定、快速、重现性好。
1实验材料
1.1仪器
LC-10AT高效液相色谱仪,SPD-10A检测器,CLASS-LC10色谱工作站;sartoriusBP211D电子天平;SHIMADZUAY220电子天平;KQ-500型超声波清洗器。
1.2试剂与药物
甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水,其它试剂均为分析纯。芦丁购自中国药品生物制品检定所(批号0080-9705)。小蓟药材分别购自江苏(南京医药股份有限公司,批号020313)、安徽(安徽省亳州市永刚饮片有限公司,批号031205)、上海(上海华宇药业有限公司,批号040802),经本院药用鉴定教研室陈建伟教授鉴定为小蓟正品[Cirsiumsetosum(Willd.)MB.]。
1.3色谱条件及系统适用性试验
1.3.1色谱条件的选择
色谱柱：LichrospherC18(4.6mm×200mm,5μm),柱温30℃,流动相：甲醇-0.5%醋酸(体积比为35∶65),流速1.0mL/min;检测波长：254nm。对照品、样品的高效液相色谱图见图1。
1.3.2提取溶剂的考察
取本品2份,各1.0g,精密称定,置2个50mL具塞锥形瓶中,分别加入50mL甲醇和50mL40%甲醇,称重,浸置1h,超声处理(功率500W,频率50kHz)40min,补足称重,滤过;微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。分别吸取上述2份溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,按外标法以峰面积计算。结果表明,以体积分数为40%甲醇为提取溶剂效果较好。
2方法与结果
2.1溶液制备
2.1.1对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品0.98mg,置25mL容量瓶中,加40%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
2.1.2供试品溶液的制备
各取3个产地药材粉末(过2号筛)1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别加入50mL40%甲醇,称重,浸置1h,超声处理(功率500w,频率50kHz)40min,补足称重,过滤,微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
2.2线性关系考察
分别精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5mL稀释10mL,依次精密吸取稀释的对照品溶液10μL注入液相色谱仪,测定其峰面积值,以芦丁的浓度(g/L)为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,进行线性回归。得回归方程为：Y=25845255X-28716,r=0.9996。结果表明,芦丁在0.00392～0.0196g/L范围内具有良好的线性关系。
2.3精密度试验
吸取3号对照品溶液10μL,重复进样5次,测定其峰面积积分值,RSD=1.503%。表明本法精密度较好。
2.4稳定性试验
分别于0、1、2、4、6、12、24h精密吸取同一份供试品溶液20μL进样,测定其峰面积积分值,计算6h内RSD=1.972%。结果表明,供试品溶液在6h内常温保存基本稳定。
2.5重复性试验
取同一批号小蓟样品共5份,每份1.0g,精密称定,按供试品溶液的制备方法平行制备5份,分别进样10μL,每份测定2次,平均含量为0.7035mg/g,RSD=1.129%。
2.6回收率试验
精密称取小蓟样品6份,各1.0g,分别精密加入芦丁对照品适量,按供试品溶液的制备方法制备,每次进样10μL,每份测定2次,取平均值,计算加样回收率,平均加样回收率为98.70%,RSD=2.88%。见表1。表1芦丁加样回收率测定结果(略)
2.7样品测定
取3个产地的小蓟样品,按供试品溶液的制备方法制备,分别精密吸取对照品溶液和样品溶液,注入液相色谱仪,测量峰面积,按外标法计算,结果总平均值为0.5808mg/g。见表2。表2小蓟中芦丁含量测定结果(略)
3小结
对于小蓟中芦丁的含量测定,有人曾采用聚酰胺薄层扫描法[1],此法受薄膜表面光洁度、均匀度、厚薄等因素影响而不太稳定,张氏等[2]采用HPLC法测定苦荞麦中芦丁含量。查阅文献,还未曾有人用过HPLC法测定小蓟中芦丁含量。本实验采用HPLC法测定芦丁含量,具有简便快速、结果准确可靠的特点,可以作为小蓟药材及饮片质量控制方法。
