经验结论
1、如果PCR产物很短,200bp以内,那么用SYBR做Q-PCR没有问题的话,可以用。
2、如果PCR产物比较长,那最好重新设计引物。
3、如果用TaqMan做Q-PCR,那很可能需要重新设计引物。这个一般产物都在100bp左右,太大了酶的外切效率太差。上海创赛科技提供0.5ml单管PCR管,平盖,无DNA,RNA酶,商品编号:C81-PCR000500-1000只/包,价格248元。
4、如果RT-PCR引物的效率不好,SYBR会降低一点PCR效率,那会导致PCR无法扩增。也只能重新设计引物。上海创赛科技提供163795-75-3,SYBR Green1,荧光染料,BR ,商品编号:D23-RS1151-100微升,价格416元。
原因
1. 产物越短,相对而言,PCR效率越高。
而qPCR如果要Relative Quantification的话,使用ddCT方法的假设是100%PCR的效率。因此产物越长越偏离这个假设。定量越不准确。特别是当跟内参做比较,而内参的扩增效率不同。这样就产生两条不同的回归线。而这两条线由于效率不同而相交。导致在交点上下的时候定量相对关系发生改变,引起明显的定量误差。这个还是要小心的。即使绝对定量,PCR效率越高,反应就越敏感,曲线的动态范围更大。也就是说可以定量的范围更广。因此一般不超过200bp。当然也确实有人做比较大的产物,但是一般不会这么推荐。
2. qPCR的目的是获得荧光数据,而不是获得PCR产物。
所以一般都以尽快完成PCR周期为目标。自然要尽量缩短每个周期的时间。如果产物太长自然要更多的延长时间。对qPCR来说实在没有必要。
CANSPEC品质提供的性能卓越,其优秀的品质满足您不同实验的多种需求,现货,产品详情,科学仪器,实验室耗材,上海创赛,海量产品特价促销中,欢迎来电咨询!