Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1. Western blot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2 h或4 °C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2 h或4 °C过夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次，5~10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10 min/次→ECL显影或NBT/BCIP显色。上海创赛科技提供SDS-PAGE蛋白质低分子量标准SDS-PAGE Molecular low weight markers for proteins 14400～97400，液体，即用型,商品编号：D23-RD1031-20次/100ul/支，价格144元。
2. 荧光分光光度计分析
原理：
活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：
收获细胞正常或凋亡细胞PBS洗涤制备细胞裂解液，加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽荧光底物)37 °C反应1 h荧光分光光度计(Polarstar)分析荧光强度(激发光波长380 nm，发射光波长为430-460 nm)。上海创赛科技提供169322-61-0，蛋白酶3底物1m，荧光Caspase 3 Substrate 1m(Apopain), fluorogenic; Ac-DEVD-AMC>95%,BR ,商品编号：C84-10931-5mg，价格551元。
3. 流式细胞术分析
方法：
收获细胞正常或凋亡细胞PBS洗涤加Ac-DEVD-AMC37 °C反应1hUV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
CANSPEC品质提供的性能卓越，其优秀的品质满足您不同实验的多种需求，现货，产品详情，科学仪器，实验室耗材，上海创赛,海量产品特价促销中，欢迎来电咨询!
