成年猪胰岛分离纯化方法的优化

　　成年猪胰岛分离纯化方法的优化

　　实验试剂

　　胶原酶V，512 kut/mg，DNA酶，胎牛血清，RPMI1640培养液，Dextran，Hanks平衡盐溶液。以上实验产品上海创赛科技均可现货供应，欢迎订购咨询。

　　实验设备

　　离心机，注射器，显微镜，超净工作台等。

　　实验材料

　　成年杂种猪，猪龄12 mo，体质量150 kg左右，猪被屠宰放血后，在相对无菌条件下迅速取出胰腺，保存于4℃ Hanks液中送至实验室，热缺血时间少于10 min，冷缺血时间少于90 min。

　　实验步骤

　　1. 胰岛分离

　　胰腺取回后，置于超净工作台上，快速去除胰周组织、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。从胰头、胰体交界部横断胰腺，找到主胰管，用20 G套管针插入，缝合线结扎，尾部远端亦结扎切断，每次均取约15-20 g组织，注入4℃含Ca2 Hanks液配制的复合胶原酶溶液(1.5 g/L，内含DNA酶0.3 g/L)，注入量 = 胰质量×2，注射速度7 mL/min，3-4 min内完成，置入玻璃容器内，在38.5±0.1℃水浴中震荡消化，震速100 r/min，在消化过程中间断加入0.1 mmol/L的NaOH，使消化液pH值尽可能维持在7.8左右，从消化20 min开始每间隔4 min取样一次，双硫腙染色镜检，当胰腺组织被消化裂解成细沙状，镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来，立即用4℃冷Hanks液(含100 mL/L胎牛血清)终止消化，充分混匀后，用40目钢网过滤，收集消化后组织，4℃离心冼涤2次，去除脂肪等杂质细胞，取样镜检计数和观察消化后胰岛分离情况。

　　2. 胰岛纯化

　　用Dextran配制成密度为1.037，1.054，1.070，1.096，1.11 kg/L的不连续密度梯度液，依次将不连续密度梯度液各10 mL加入50 mL离心管中，最后将洗涤后的消化组织每0.5 mL与1.037 kg/L密度梯度液10 mL混匀，小心移至离心管中液体上层，形成不连续密度梯度。将2-4个离心管置入低温离心机中，先800 r/min离心5 min，然后2 500 r/min离心15 min，离心后在1.096-1.054 kg/L之间收集纯化的胰岛，4℃离心洗涤2次。分别取样镜检计数，估计纯度和行生物学活性及组织学鉴定。上海创赛科技提供正品猪胰岛素Elisa试剂盒|Porcine Insulin,INS ELISA Kit ，商品编号：LH-E10090PO-48T，价格1381.25元。

　　3. 胰岛计数和纯度测定

　　分离纯化后的组织悬液用双硫腙(双硫腙10 mg，无水乙醇3 mL，250 g/L氨水50 mL)进行染色，光镜下胰岛细胞团染成腥红色或红色，外分泌组织不着色，呈圆形、椭圆形或不规则形.在显微镜下计数直径≥50 mm的胰岛算出每克胰腺组织分离的胰岛当量数，纯度用内、外分泌组织量的比值来估计。上海创赛科技提供60-10-6，双硫腙Dithizone，AR，商品编号：D23-RS1258-5克，价格64元。

　　4. 胰岛生物学活性鉴定

　　将纯化后胰岛细胞悬液放置在显微镜下，用巴氏吸管吸取胰岛放入培养板中，每10个胰岛当量(每1个胰岛当量相当于直径150 mm的胰岛细胞团，IE)的成年猪胰岛(APIs)置入一个培养孔，6孔为1组，共4组.每组分别置入无糖培养基、含5.6 mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶碱(高糖 茶碱)的RPMI1640培养液中，置于37℃、含50 mL/L CO2的培养箱中孵育4 h，收集培养液，用胰岛素放免试剂盒(中科院原子能研究所)测定胰岛素含量。上海创赛科技提供1ml巴士吸管，巴斯德吸管(长度150mm,100支包装，已消毒)，商品编号：C81-PP001010-100支/包，价格17元。

　　5. 胰岛组织学检查

　　离心纯化后胰岛细胞悬液，收集胰岛组织，用无水酒精固定，石蜡包埋切片，HE染色检查胰岛组织结构完整性。

　　6. 统计学处理

　　所得数据以mean±SD表示，组间均数差异用t检验比较，P<0.05为有差异。

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