【基本原理】
真核生物的DNA主要存在于细胞核内,以双链线性高分子形式存在。DNA提取的主要过程是:破碎组织和细胞,去除与核酸结合的蛋白质及其它多糖、脂类等生物大分子,本实验通过蛋白酶K 和SDS 使蛋白质变性,再用酚/氯仿除去蛋白质,用乙醇使DNA 沉淀,经A260/A280检测DNA含量,再经琼脂糖电泳鉴定。
【器材】
1.玻璃匀浆器
2.台式离心机
【试剂】
1.DNA提取缓冲液:
10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)
0.1mol/L EDTA (pH 8.0)
20μg/ml 胰RNA酶
0.5% SDS
2.蛋白酶K 20mg/ml
3.饱和酚
4.NaAC(pH5.2)3 mol/L
5.1×TE(pH8.0)
6.100%乙醇
7.70%乙醇
【操作步骤】
1.取新鲜肝组织0.2g,加1.2ml DNA提取缓冲液制成匀浆,勿使细胞核破碎。
2.加6μl RNase(20mg/ml),倒入Ep 管中,37℃水浴保温30min,然入加6μl蛋白酶K(终浓度50μg/ml),50℃保温2h。
3.取0.5ml 保温液,加0.5ml 饱和酚,充分振荡混匀,于10 000rpm离心10 min,将上层水相转入Ep 管中,加等体积氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀后,10 000rpm 离心10min。
4.上层水相转移至Ep管中,加50μl 3mol/L NaAc,加2-2.5倍体积的无水乙醇,离心同上。
5.小心弃出上清,沉淀加70%乙醇离心洗涤一次,保留沉淀,使之自然干燥,加适量的水或TE溶解。
6.进行核酸定量测定和电泳鉴定。
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