体外暴露染毒技术改进后实验重复性的提高

　　1.简介：

　　目前的体外暴露染毒研究中，受试化合物可在气液界面直接与细胞接触(Cultex)，避免了传统浸没培养暴露中培养基成分对实验的干扰。在此气-液界面体外暴露染毒过程中的实验重复性(稳定性和再现性)取决于细胞体外暴露染毒技术及暴露系统的优化设计。

　　在文献中，我们常见到的受试物在气液界面直接与细胞暴露接触的体外暴露染毒方案有不同类型(Aufderheide，2005;Aufderheide et al.，2005)。在这里，我们把两个主要应用的模块类型，即线性流体外暴露染毒系统(Linear Flow System)和辐射流体外暴露染毒系统(Radial Flow System)进行实验测试对比，以讨论这两种方法的差异。

　　2. 材料与方法

　　2.1 体外暴露染毒系统

　　2.1.1 CULTEX CG(线性流暴露染毒系统Linear Flow System) 第一代气液界面体外暴露染毒系统 见图1，主要特点是细胞培养小室及进气气溶胶入口线性分布，上下两个模块形成紧密的封闭系统。底部模块为细胞培养部分，具备37℃水浴及可流动的培养基供给;顶部是与培养小室对应分布的线性的气体进出模块，通过在后端连接的抽气泵，在密闭腔室内实现负压，所需暴露物质不停进入密闭系统内完成暴露染毒后才从后端排出。细胞培养小室中形成良好的细胞培养环境，其中的细胞并可与顶部进来的气体进行直接接触，实现直接的气液界面暴露。该系统适用12 mm细胞培养小室。

　　2.1.2 CULTEX RFS(辐射流暴露染毒系统Radial Flow System) 第二代暴露气液界面体外暴露染毒系统(http://www.bio-launching.com/s02/product/2012/10/24/16298667.html) 见图2，图3，是一套全新设计的体外暴露染毒系统模块。采用新型的辐射性管理气路设计：底部模块中的细胞培养(三个或六个)小室呈对称辐射分布、顶部模块的进气口直接分成辐射对照分布的三个(或六个)进气通道，密闭后顶部进入气体直接与底部小室内对应的细胞进行接触暴露。同时系统提供可持续流动的培养基以及360度分布的水浴，保证体外细胞培养环境。

　　2.1.3 CULTEX DG颗粒物气溶胶发生器( Wright 1950 )，全自动干粉状颗粒物气溶胶发生器，进料速度 800 U/min, 气流大小 8 L/min，暴露的时间和颗粒类型见附表1。

　　表格1 实验物质的主要参数

　　2.1.4 全自动香烟烟雾发生器，K3R4F 研究性香烟(University of Kentucky, Lexington, KY, USA)，吸烟参数设置35 mL puff volume/2 s, 1 puff per minute, 7 puffs per cigarette，通气流量1L/min。

　　2.1.5 颗粒物沉积，颗粒物沉积如图5所示，在细胞小室内沉积的颗粒物均在玻璃纤维膜上(Type: MNGF-1; Machery-Nagel, Germany)，玻璃纤维膜通过Clip Fit(图4)装置固定在细胞培养小室内，实验称重分析天平(SE2F Microbalance, readability: 0.1 mg; Sartorius GmbH, Germany)。

　　3. 结果

　　不同粒径及质量的颗粒物在两种不同暴露染毒模块内有不同的沉积结果。通常情况下，虽然粒子的理化性质及粒径大小可能会对颗粒沉积有影响，但在同一粒子的暴露结果可以看出，辐射流暴露染毒系统CULTEX RFS中三个位置暴露数据的具有更低的偏差和相对标准偏差，且相对标准偏差都在5%以内。线性流暴露染毒系统CULTEX CG的相对标准偏差全部大于10%，其精密度及三通道间的实验平行性及重复性均较差。

　　表格2 Pural 200暴露30分钟后在玻璃纤维膜上沉积质量及分析

　　3.1 高纯氧化铝Pural 200

　　3.1.1高纯氧化铝Pural 200的粒径范围为40纳米～40微米。线性流暴露染毒系统和辐射流暴露染毒系统采用同一个气溶胶发生器进行发生。相同暴露时间后，暴露前后分别对玻璃纤维膜进行称重，获得膜上沉积颗粒重量见附表2。

　　3.1.2两个暴露模块实验数据表明，平均而言，在颗粒物沉积的质量上，线性流暴露染毒系统超过辐射流暴露染毒系统。但在同一时间，辐射流暴露染毒系统的三暴露染毒位置获得的数值变化幅度显著减小。这意味着，辐射流暴露染毒系统三个腔室能够更加平等的分布颗粒，通道间的平行性更好，实验重复性和稳定性更佳。为了研究这方面，我们进一步研究其他两种颗粒化合物氧化铜微米颗粒和氧化铜纳米颗粒。

　　3.2 氧化铜微米颗粒

　　氧化铜颗粒粒径<5mm，实验数据如表3所示，我们观察到1、辐射流暴露染毒系统中的沉积数据具有非常高的重复性，而线性流暴露系统沉积的数据偏差相当大;2、颗粒在玻璃纤维膜上沉积的分布差异非常大如图6，线性流暴露系统中颗粒主要集中分布在膜中央，而辐射流暴露系统中颗粒非常均匀的分布在整张膜表面上。

　　表格3 氧化铜微米颗粒暴露30分钟后在玻璃纤维膜上沉积质量及分析

　　表格4 氧化铜纳米颗粒暴露30分钟后在玻璃纤维膜上沉积质量及分析

　　3.3 氧化铜纳米颗粒

　　氧化铜颗粒粒径<42nm，实验数据如表4所示，观察到与氧化铜微米颗粒实验类似的效果，线性流暴露系统沉积的数据偏差比辐射流暴露系统高很多，而玻璃纤维膜上颗粒的沉积分布辐射流暴露系统则更加均匀一致如图7。

　　表格5 K3R4F烟气颗粒暴露30分钟后在玻璃纤维膜上沉积质量及分析

　　3.4 主流烟(K3R4F research cigarettes)

　　香烟烟雾的对比实验进一步证实了前面实验所取得的结果，数据见表5。如表5数据所示，我们可分析认为线性流暴露系统中颗粒沉积具有非常大的不稳定性，数据偏离较高，辐射流暴露系统具有非常稳定而可重复的颗粒沉积效应。

　　4. 讨论

　　在受试物为气体时，细胞培养小室和气溶胶入口是否为线性排列，并不重要，因为，气体的分布是均匀的。但当受试物为颗粒物气溶胶时，由于其具有复杂颗粒物粒径大小分布及物理化学性质，其线性方向运输将对其颗粒物的沉积产生非常大的影响。(1)颗粒物浓度及粒径分布在稀释系统中的稳定性收到影响;(2)在不同的细胞小室上沉积的粒子浓度及粒径将发生变化，导致在不同的细胞小室内沉积颗粒的平行性和重复性较差。显然，压缩空气的进气稀释是无法打破受试物质的层流分布，这将无法改变如上所述沉积效应的产生。

　　考虑到这些缺点，细胞培养小室和气溶胶入口分布需要进行根本性的改变。为了避免受试颗粒物暴露的不均匀性，Cultex推出的全新概念的二代暴露染毒模块Cultex RFS。在这里，气溶胶将通过一个带有喷嘴(Mohr, 2013)的中央入口统一进入，在喷嘴处气溶胶将均匀分散到三个中央辐射分布的通道内，通过该通道进入辐射分布的细胞培养室内，如此过程后，气溶胶在三个细胞小室内沉积的均一性和重复将大大提高。该实验中不同颗粒沉积后的图片和数据结果都显示了非常好的效果，三个细胞小室间颗粒沉积偏差和标准偏差都非常理想。与第一代线性流系统比较，我们发现二代辐射流暴露染毒模块损失了部分颗粒，即每个细胞小室内沉积颗粒总质量在减少。这是由于Cultex RFS模块中我们增加了大颗粒物(凝聚粒子)预分离技术，降低了大的或凝聚在一起的颗粒沉积到细胞表面的可能，即提高了颗粒物粒径分布的均一性，使实验受试物更稳定。既减小了粗颗粒对实验的影响，又进一步提高了实验重复性和稳定性。

　　总之，体外暴露染毒系统结构的设计优化，对体外暴露染毒实验重复性的提高起到决定性作用，在体外暴露染毒技术上具有划时代的意义。