防止免疫组化切片干燥的新方法
为防止免疫组化切片干燥,我们经过反复摸索,总结出在清洗缓冲液中加入表面活性剂吐温20(Tween-20)防止干片的方法,已使用2年余,效果良好。现介绍如下。
1、材料与方法
1.1材料
PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.2~7.4)、Tween-20、500ml容量瓶和吸水纸。
1.2方法
取500ml已配制好的PBS磷酸盐缓冲液置容量瓶中,向瓶中加入2~3滴Tween-20,充分混匀。对10张不同组织的切片按照免疫组化染色步骤行常规PBS磷酸盐缓冲液清洗切片后,将切片置入配制好的PBS-Tween-20缓冲液中,上下提拉几次,让其均匀覆盖在整张切片上,再用吸水纸擦去周围多余的液体,放入湿盒中,即可滴加试剂进行下一步操作。为了防止边缘效应的发生,要求距组织边缘<2mm处擦拭,同时用蜡笔及牙签方法处理10张对照片。
2、结果
使用蜡笔组有2例在抗体孵育过程中组织边缘干燥,发生了边缘效应,而加入Tween-20组均未发生边缘效应,染色更加均匀。加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。
3、讨论
免疫组化染色中,切片干燥会使抗体与组织发生非特异性结合,造成假阳性。尤其组织边缘,如果抗体覆盖不充分容易发生干片,造成非特异性染色,即“边缘效应”[1]。过去常用的方法是使用蜡笔和湿盒,由5蜡笔使用起来比较麻烦,需要经常更换,现多数单位使用专用的免疫组化油笔。使用蜡笔或免疫组化油笔都只能防止滴加的试剂不向四周流失,如果组织偏大就无法保证一次性将滴加的试剂完整覆盖整个组织,需要借助其他工具(如牙签等)将抗体覆盖全部组织,这样就增加了免疫组化操作的复杂性,还有可能导致抗体覆盖不均增加干片的可能性。Tween-20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物。由于其分子中有较多的亲水性基团(聚氧乙烯基),故亲水性强,具有乳化、扩散、增溶、稳定等性能,是一种常用的非离子性去垢剂和表面活性剂,对人体无害,无刺激性,常用为医药品的乳化剂、扩散剂和稳定剂。将切片浸入其中能够均匀覆盖整张切片,如同在切片上增加了一层液体膜,不会使组织和切片空白区形成明显的分界线,用吸水纸在离组织边缘<2mm处擦拭后,缓冲液能够在组织周围形成一个很清楚的界限,此时滴加的试剂能够很均匀地分散在所有组织上,让整张切片染色均匀。由于缓冲液的表面张力作用,被封住的试剂不会向四周流散,且能够在组织上残留相对较多的缓冲液,更好地防止了干片的发生,避免造成边缘效应。另外,由于Tween-20是去垢剂,也能够让组织切片清洗得更干净,避免了非特异性染色的发生。该方法在本实验室已使用2年余,做过多次与不加Tween-20液的对照实验,发现Tween-20对免疫组化染色结果无影响,可以放心使用。且PBS-Tween-20缓冲液配制方法简单,一般实验室均能完成操作;价格便宜,节约了医疗成本并易于推广应用。
参考文献:
[1]周晓鸽。免疫组化染色过程中存在的问题及对策[J]。诊断病理学杂志,2004,1(4):211-213.