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人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法

中国教育装备采购网 2020/4/14 13:53:21 围观391次 我要分享

  人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法 本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中凝血因子Ⅱ(FⅡ)的含量。

  人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法实验原理:

  本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人凝血因子Ⅱ(FⅡ)水平。用纯化的人凝血因子Ⅱ(FⅡ)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中加入凝血因子Ⅱ(FⅡ),再与HRP标记的凝血因子Ⅱ(FⅡ)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成z终的黄色。颜色的深浅和样品中的凝血因子Ⅱ(FⅡ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人凝血因子Ⅱ(FⅡ)的含量。

  人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法样本处理及要求

  1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

  2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

  3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

  4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

  5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

  6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.

  7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

  人凝血因子Ⅱ(FⅡ)酶联免疫ELISA法操作步骤

  1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在D一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在D一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从D一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为240ng/ml,160ng/ml ,80ng/ml,40ng/ml,20ng/ml)。

  2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品Z终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

  3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

  4.配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

  5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

  6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

  7.温育:操作同3。

  8.洗涤:操作同5。

  9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

  10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

  11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

点击进入上海广锐生物科技有限公司展台查看更多 来源:中国教育装备采购网 作者:上海广锐生物科技有限公司 责任编辑:张肖 我要投稿
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