苯二氮卓类药物（Benzodiazepines, BZDs）属于中枢神经系统药物，具有抗焦虑、抗癫痫、抗惊厥、催眠等药理作用具有较好的疗效。由于BZDs结构相似，疗效类同，很多BZDs的治疗量与中毒量、致死量相接近，过量使用易引起中毒乃至死亡。此外，许多麻醉抢劫、麻醉强奸案件都有涉及这类药物。然而，由于BZDs在体内的浓度随代谢过程逐渐降低，很多刑事案件检材，特别是药物在血、尿中已含量甚微，难以被检测。因此，建立简单、快速、灵敏、准确的检测方法，用于快速定量筛查体液(血、尿)中痕量BZDs的总含量是十分必要的，对促进医疗用药及刑事侦查的发展具有积极的意义，也是很有挑战的课题。
相比于传统的液相色谱和LC-MS方法，表面增强拉曼光谱(SERS)具有超高灵敏度，且可直接给出被检分子的结构信息，还具有快速、无损的特性，在生化样品分析中具有独特的优势。实现SERS检测的关键在于SERS基底的构建。传统贵金属(Ag, Au)SERS基底尽管SERS活性高，但其价格昂贵，不利于商业化应用。目前比较普遍的做法是在半导体氧化物(ZnO, TiO2)上负载少量贵金属纳米粒子，其增强机理不仅有贵金属本身的电磁(EM)增强机理，还具有贵金属与半导体氧化物间的电荷转移(CT)增强机制，进而增强SERS活性，提高检测的灵敏度。此外，贵金属晶面对SERS活性也有重要的影响，特别是本课题组采用置换反应合成了Ag(111)晶面取向生长的大尺寸Ag纳米片，这种Ag纳米片由于晶面取向的优势在检测罂粟碱时表现出高SERS活性和选择性。显然，目前的合成方法制备半导体氧化物-贵金属纳米复合材料虽有助于减少贵金属用量，但也失去了晶面取向带来高SERS活性的优势。因此，如何既保持贵金属晶面取向优势，又实现与半导体氧化物间的CT协同增强机制，是本工作重点解决的课题。
该研究在课题组合成大尺寸Ag纳米片的基础上，采用化学修饰方法在Ag纳米片上生长ZnO纳米粒子，对其结构、组成和形貌进行表征。通过对ZnO纳米粒子负载量的优化实验发现，只有合适的ZnO负载量(17.5 wt%)才有SERS性能，且具有高SERS检测稳定性和均一性(图1)。基底在空气氛围环境中放置30天，其SERS强度仍保持初始强度的93％，优于纯Ag纳米片的81％。如果在Ag纳米片表面修饰非半导体氧化物(SiO2)时，其SERS信号强度随SiO2负载量单调性下降，这充分说明Ag与ZnO间CT协同机制的存在。除一系列实验(XPS,光电流测试和CT增强程度PCT的计算等)分析外，还应用分子动力学模拟(MD)计算分析了作用在该基底上的探针分子键能变化，发现当ZnO 修饰密度为0.106 NPs /nm2时基底与探针分子的键能*大(-19.1 eV)，为分析Ag与ZnO间的CT增强机制提供理论依据 (图2)。
图1：Ag纳米片表面负载ZnO纳米粒子的表征。
图2：基于Ag-ZnO-探针分子间CT增强机理的研究
在上述基础上，优化后的Ag NS/ZnO基底应用于艾司唑仑（EST，为传统BZDs药物）的灵敏检测，线性范围为10-9至10-3M，检出限低至0.5 nM, 优于文献报道的HPLC、电化学及ELISA等经典方法的结果；表现出优异的选择性，即使分别加入100倍以上浓度的无机盐、有机物、氨基酸和其他药物等，都没产生明显的干扰。通过在人体尿液、牛血清蛋白中加标回收实验，获得满意的回收率和RSD值(≤3.71％)，表明该基底在EST的检测应用中具有很好的可靠性 (图3)。
图3：SERS检测单一药物EST含量的线性图及其抗干扰性。
进一步应用于5种BZDs药物总量的快速检测，包括EST、奥沙西泮(OXA)、阿普唑仑(ALP)、三唑仑(TRI)和劳拉西泮(LOR)。由于此5种为同系物，有相同的骨架，拥有共同的特征峰，位于1163 cm-1，且浓度相同，对应的峰强度也不变。激光共聚焦拉曼光谱仪为利用EST的线性工作曲线来定量检测BZDs总含量提供了可行之处 (图4)。在此，准备了12个混合样品，包括两种、三种、四种或五种BZDs药物的混合，也有浓度差异。实验测试结果表明，BZDs药物的总浓度可以从EST的线性工作曲线直接获得，测试结果与总加标浓度具有很好的吻合度。将BZDs混合样注射到小鼠体内，随小鼠代谢采集不同时间的小鼠血清，发现血清中BZDs药物总量随小鼠代谢过程在开始阶段迅速增加，12 h达到*大值，此后逐渐降低。这一变化趋势与LC-MS/MS检测结果一致，说明该基底及其SERS检测方法对于定量检测BZDs药物是可靠且*效的。
图4：快速检测BZDs总含量。
综上，该工作开发了一种SERS定量分析方法，仅利用一种BZD药物作为标准品即可定量测定法医和生物医学环境中BZDs药物总量，从而可针对族类药物总量快速、灵敏的筛查。这是通过在大尺寸(111)晶面Ag纳米片上修饰少量ZnO为SERS活性基底来实现的，其既结合Ag(111)晶面取向优势又实现了CT增大效应，表现出优异的SERS活性和稳定性。该基底成功应用于血清和尿样中EST浓度的高灵敏度和高选择性SERS检测。并进一步应用于5种BZDs药物总浓度的检测，特别是成功监测了随小鼠代谢过程中小鼠血清中BZDs药物总量的变化趋势。该研究工作瞄准族类药物的靶向筛查模型，可作为急诊诊断和法医鉴定极具价值的分析工具。
该研究工作发表于Anal. Chem.2021,93,3403-3410；入选Anal. Chem.第93卷第7期封面文章。
【兰州大学叶为春教授课题组】
文章信息
这一成果以“Group-Targeting SERS Screening of Total Benzodiazepines Based onLarge-Size (111) Faceted Silver Nanosheets Decorated with ZincOxide Nanoparticles”为题发表在Analytical chemistry上。兰州大学叶为春教授为论文通讯作者。
文章链接https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04399
本研究采用的是北京卓立汉光仪器有限公司 “Finder Vista”激光显微共聚焦拉曼光谱仪系统，如需了解该产品，欢迎咨询我司。
免责说明北京卓立汉光仪器有限公司官网及公众号所发布内容（含图片）来源于原作者提供或原文授权转载。文章版权、数据及所述观点归原作者原出处所有，北京卓立汉光仪器有限公司发布及转载目的在于传递更多信息及用于网络分享。
如果您认为本文存在侵权之处，请与我们联系，会及时处理。我们力求数据严谨准确，如有任何疑问，敬请读者不吝赐教。我们也热忱欢迎您投稿并发表您的观点和见解。
