高活性高选择性 PAK4 抑制剂的发现 | MedChemExpress

　　P21 活化蛋白激酶（p21-activated protein kinase, PAK）作为一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是 Rho 家族中的小 GTP 酶 CDC42 及 Rac1的效应蛋白，介导其下游信号通路的转导。 PAK4 是 PAKs 中的一员，当 PAK4 表达异常时，细胞发生癌变。Wang C 等研究表明^[1]，PAK4 在肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌细胞中的表达含量远远高于正常细胞，对肿瘤的发生、发展、侵袭和迁移产生重要影响。因此，PAK4 抑制剂的开发是多种肿瘤治疗行之有效的策略之一。

　　Hao C 等^[2], 基于药物的结构，设计并合成了一系列氨基喹唑啉类 PAK4 抑制剂，同时对该系列化合物进行选择性和药代动力学性质优化，获得了一个高活性高选择性的 PAK4 抑制剂 31（CZh226）。它对 PAK4 的 Ki 值为 9 nM，对多种激酶表现出优秀的选择性，其中对 PAK1 的 Ki 值为 3112 nM，选择性差异达到了 346 倍。多种优秀的药效和药代动力学参数使得化合物 31被选做先导化合物，进一步进行抗癌药物的开发。（图1）

图1. 化合物 31的结构式（图片来源：《J. Med. Chem.》）

　　研究者随后探究了 PAK4 与化合物 31的作用模式，共晶复合物结构显示，化合物 31 的氨基吡唑与 Glu396 和 Leu398 形成氢键并相互作用，环丙基与 Met395 和Val335 形成了很强的疏水相互作用，哌嗪环上的 NH 与 Asp458 的羧基形成氢键作用，Asp444 的羧基通过诱导分子的构象变化进而与哌嗪环上的 NH 形成静电作用。而化合物 31与 PKA1 的预测结合模式显示，氨基酸残基 Asp407 侧链发生位移，从而难以与哌嗪环上的 NH 形成静电作用。此外，化合物 31与 PKA4 对接打分优于其与 PKA1 的对接打分，这些结果与体外选择性实验结果一致。（图2）

图2. （A，C）PAK4 与化合物 31 的共晶结构（PDB：5XVG）；

（B，D）PAK1与化合物31的预测结合模式（图片来源：《J. Med. Chem.》）

　　激酶谱实验显示，化合物 31在 0.1 μM 和 1.0 μM 浓度下对多种激酶具有很好的选择性。其中，在 0.1 μM 的筛选浓度下对 PAK4 产生超过80%的抑制（PAK4 IC₅₀=0.0111 μM），这可能是由于化合物 31与 PKA4 蛋白的 DFG 模块在空间上可以更好的结合。（图3）

图3. 化合物 31在 0.1 μM 和1.0 μM 下对 54 个激酶的选择性（图片来源：《J. Med. Chem.》

　　通过细胞实验进一步评价化合物 31 对 PAK4 的抑制作用。首先采用非小细胞肺癌细胞株 A549 来评价化合物的抗增殖作用。其次，采用 HEK-293 细胞（人类胚胎肾 293 细胞）和生长不依赖于 PAK4 的 NCI-H460 细胞株（人类大细胞肺癌细胞）来评价化合物的潜在脱靶效应。结果显示，化合物 31 对 A549 细胞（图 4A）具有中度的抗增殖活性，这一相对较低的细胞生长抑制活性结果表明，PAK4 可能不是这些癌细胞增殖的“驱动力”。随后使用划痕法和 Transwell 法评估化合物 31 对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响，未给药的 A549 细胞在划痕后的 2天内，大部分的划痕部位都被填满了，而给予一定剂量的化合物 31 后则显著抑制了伤口愈合（图 4B）。这一结果表明化合物 31可显著抑制 A549 细胞迁移和侵袭（图 4C）。与此相反，NCI-H460 和 HEK-293 细胞迁移和侵袭的减少并不明显，这表明化合物 31 对细胞活性的抑制是通过抑制 PAK4 而产生的。（图 4）

图4. 化合物 31 通过抑制 PAK4 激酶活性调节下游信号通路来抑制 A549 的迁移和入侵

（图片来源：《J. Med. Chem.》）

　　小M 的小思考：

　　PAK4 作为一种有潜力的药物开发靶点，其抑制剂的开发为治疗相关的癌症提供了新思路。截至目前，PAK4 的抑制剂数量很少，且多数抑制剂的活性不理想。目前已经进入临床阶段的小分子抑制剂有 KPT-9274 和 PF-3758309，其具有良好的 PAK4 抑制效果和药代动力学性质。本文发现了一个新型、有效高选择性的 PAK4 抑制剂 31（CZh226），它通过抑制 PAK4 激酶活性，调节 PAK4 的下游信号通路，抑制了A549 肿瘤细胞的迁移和入侵，是一个有潜力的先导化合物，可用于进一步抗癌药物的开发。

　　Reference：

　　[1] Wang C, et al. Oncogenic PAK4 regulatesSmad2/3 axis involving gastric tumorigenesis.Oncogene.2014 Jun 26;33(26):3473-84.

　　[2] Hao C,et al. Structure-Based Design of 6-Chloro-4-aminoquinazoline-2-carboxamideDerivatives as Potent and Selective p21-Activated Kinase 4 (PAK4) Inhibitors. J.Med. Chem., 2018, 61 (1), 265–285.

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