一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称厂家型号
脱水机武汉俊杰电子有限公司 JJ-12J
包埋机武汉俊杰电子有限公司JB-P5
病理切片机上海徕卡仪器有限公司RM2016
冻台武汉俊杰电子有限公司JB-L5
组织摊片机浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-P
烤箱上海慧泰仪器制造有限公司DHG-9140A
载玻片江苏世泰实验器材有限公司80312-3181
盖玻片江苏世泰实验器材有限公司10212432C
微波炉格兰仕微波炉电器有限公司P70D20TL-P4
脱色摇床谷歌生物TSY-B
涡旋混合器谷歌生物MX-F
掌上离心机谷歌生物D1008E
移液枪DragonKE0003087/KA0056573
组化笔Gene techGT1001
正置荧光显微镜日本尼康Nikon Eclipse C1
成像系统日本尼康Nikon DS-U3
2、主要实验试剂
试剂厂家货号稀释比
无水乙醇国药集团化学试剂有限公司
二甲苯国药集团化学试剂有限公司
EDTA（PH8.0)抗原修复液谷歌生物G1206
EDTA(PH9.0)抗原修复液谷歌生物G1203
柠檬酸（PH6.0)抗原修复液谷歌生物G1202
PBS缓冲液谷歌生物G0002
自发荧光淬灭剂谷歌生物
BSA谷歌生物G5001
一抗
荧光二抗
DAPI谷歌生物G1012
抗荧光淬灭封片剂谷歌生物G1401
二、石蜡切片免疫荧光实验步骤
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）
3、画圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。
5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
7、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
8、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
9、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光
三、石蜡切片免疫荧光结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光
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