鼠尾胶原蛋白的使用方法

　　1、细胞培养器皿的表面包被

　　推荐浓度：1-5ug/cm2，以包被浓度为 2 ug/cm2 为例：

　　用无菌0.006mol/L(0.36g/L) 乙酸将胶原蛋白稀释到0.012mg/ml。确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干。也可以在室温放置 1小时后，用PBS洗3-4次后直接使用。

　　包被好的器皿在 4-25℃至少可保存3个月以上的时间。

　　2、三维胶原的制备

　　鼠尾胶原蛋白I型在浓度1mg/ml以上，pH 7左右时可形成具有一定强度三维胶,建议成胶浓度1-2mg/ml。胶原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中，在成胶过程中需要加入0.06X 体积的 0.1mol/L NaOH 来中和。

　　需要的溶液 ( 均需要无菌、预冷 ): 10xPBS( 可含10 mg/L的酚红用于 pH 指示 )或 10x 培养液 , 0.1mol/L NaOH, 0.1mol/L 乙酸(一般不用), 双蒸水

　　A.不含细胞的三维胶原的制备(以配制1毫升，1mg/ml三维胶为例)：将200ul生友鼠尾胶原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的离心管中，加入 690ul H2O。然后加到12ul 0.1mol/L NaOH中(如果反过来把12ul 0.1mol/L NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结)，立即混匀。再加入100ul 10xPBS或10x培养液，混匀后立即加到培养器皿中(混匀后pH为7左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试)。将培养器皿在室温(25度左右)下放置20分钟待胶凝固后，转移到培养箱内。如果配制中使用的是10xPBS，使用前需要加入适当体积的细胞培养液预平衡。

　　B.含细胞的三维胶原的制备(以配制1毫升，1mg/ml三维胶为例)：准备好悬浮于培养液的细胞，并放置于冰浴中。将200ul鼠尾胶原蛋白I型 (5mg/ml)加到12ul 0.1mol/L NaOH中(如果反过来把12ul 0.1mol/L NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结)，立即混匀。再加入23ul 10xPBS或10x培养液，混匀(混匀后pH为7左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试)。加入760ul的细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。将培养器皿在室温下放置20分钟待胶凝固后，加入适当体积的细胞培养液，转移到培养箱中培养。上海创赛提供鼠尾胶原蛋白I型,C20-200110-2ml,价格：280元

　　注：鼠尾胶原蛋白I型在室温下pH中性时可迅速成胶，在操作过程中要尽量保持低温。

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