[科研前线│M-PEA丨Handy PEA丨FMS-2]谷氨酸和谷氨酰胺通过预激活光保护途径使红球藻在培养相移期间快速适应强光

　　微藻红球藻以其生产高价值产品虾青素的能力而闻名。虾青素是一种叶黄素类胡萝卜素，由于其强大的抗氧化和着色特性，广泛应用于水产养殖、营养品和化妆品等行业。然而，在规模化培养这种微藻时，科研人员和生产者却面临着一个棘手的问题。红球藻的生产通常采用两阶段培养法：第一阶段是“vegetative phase”，在适宜的光照条件下让细胞快速增殖；第二阶段是“induction phase”，通过高光、缺氮等胁迫条件诱导虾青素积累。从温和的低光环境突然被转移到强光下时，红球藻来不及适应这种剧烈的光照变化，结果导致光系统受损、细胞死亡、藻液褪色、生物量锐减。

　　近期，中科院海洋所的刘建国课题组发现了一个简单而有效的解决方案：在光照转换前的暗期，向培养基中添加谷氨酸（GU）或谷氨酰胺（GN），红球藻的死亡率从41.49%骤降至3%以下。其研究结果“Glutamate and Glutamine Enable Rapid Acclimation of Haematococcus lacustris to High‐Light During Culture Phase Shift by Pre-Activating Photoprotective Pathways”发表在《Plant, Cell & Environment》期刊上。该研究中，使用英国Hansatech公司生产的Handy PEA、FMS-2和M-PEA测定了OJIP曲线及参数、叶绿素荧光淬灭、环式电子传递、叶绿体呼吸、光呼吸及PSⅠ活性等指标，并结合蛋白表达和代谢物水平，系统阐述了外源GU/GN通过预先激活红球藻光保护机制，帮助其快速适应高光胁迫的机理。

　　外源施加GU或GN后，藻细胞死亡率骤降，且细胞密度均显著高于对照。PSⅡ的最大光化学效率（Fv/Fm）是光抑制/光损失的关键指标。强光处理后，GU组和GN组的Fv/Fm值显著高于CK组。结果表明，谷氨酸和谷氨酰胺有效地减轻了连续强光暴露引起的光抑制，防止细胞漂白和细胞密度下降，从而加速了红球藻的生长。

　　在整个试验期间，GU组和GN组PSII实际光化学效率（φPSII）均高于CK组。光适应的最大光化学效率（Fv′/Fm′）和光化学猝灭系数（qP）反映了天线能量转换的最大潜在效率和开放的PSII反应中心比例。GU和GN组的Fv′/Fm′在最初1h显著高于CK组；强光处理1h后，CK组qP明显下降，GU组和GN组qP下降幅度明显较小，且qP值明显高于CK组。这表明，外源GU和GN提高红球藻光合能力的主要原因是阻止了PSII反应中心的关闭，而GN组的Fv/Fm和φPSII值最高，说明外源GN的光保护作用比GU强。

　　图1 外源GU和GN对红球藻细胞生长和光合性能的影响OJIP曲线的形状和820nm曲线的变化分别与PSII和PSI的活动密切相关。强光照射6h后，CK组OJIP曲线振幅明显下降，GU和GN组的OJIP曲线变化较小。820nm曲线显示三种处理在高光处理下PSI的活性不受影响。这表明，强光处理期间红球藻的光抑制发生在PSII，而GU和GN可以缓解这种光抑制。

　　图2 强光处理和恢复后PSII和PSI活性的变化强光处理后，各处理组每个PSII活性反应中心的光吸收通量（ABS/RC）随时间逐渐增加，但每个PSII活性反应中心的激发能捕获通量（TRo/RC）最初增加，然后减少。每个PSII活性反应中心的电子传递通量（ETo/RC）和每个PSII活性反应中心的耗散通量（DIo/RC）分别逐渐减少和增加。这表明，大部分的激发能量没有被捕光天线传给反应中心并用于电子传递，而是被耗散了。与CK组相比，GU和GN组这些参数的变化更温和些。强光处理6h后，GN组的TRo/RC和ETo/RC明显高于CK组。此外，GU和GN组电子传递量子产率（φEo）和超过QA的电子传递效率（ψo）明显高于CK组，表明GU和GN在相移后的强光下具有更大的光合电子传递能力。K阶（WK）和J阶（VJ）处相对可变荧光的变化通常反映了PSII供体侧（放氧复合物OEC）和PSII受体侧（QA-QB）的状态。GU和GN组的WK和VJ均显著低于CK组，表明外源GU和GN在一定程度上维持了红球藻PSII的稳定性，减轻了强光对供体和受体侧的伤害。更重要的是，GU和GN组在相移突变后表现出对强光的有效适应，从而防止了光能吸收和利用的失衡，这表明GU和GN在相移突变前的暗适应阶段就已经激活了光保护策略。

　　性能指数PIABS与光合机构的能量守恒和活性密切相关，代表光合性能的最敏感指标，因为它整合了光吸收效率（RC/ABS）、初级光化学的量子效率相关的性能[φPo/（1-φPo）]和将激发能转换成电子传输的量子效率相关的性能[ψo/(1 − ψo)]。GU和GN组的PIABS显著高于CK组，这表明，外源GU和GN有效地提高了强光下红球藻的光合能量利用能力和效率，从而提高了湖藻在光相转换过程中的耐受性。另外，短期暴露于强光下引起的光损伤是可逆和可恢复的。但GU和GN在促进光损伤恢复方面没有发挥作用。

　　图3 高光处理和恢复下红球藻叶绿素a荧光参数的变化根据代谢结果发现，外源性GU和GN赋予红球藻对突然强光暴露的快速适应能力不依赖于细胞内代谢调节（图4）。蛋白质丰度的结果表明，谷氨酸和谷氨酰胺可能通过调节光合机构蛋白表达以外的机制发挥其光保护作用。但卡尔文循环的关键酶-核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco）在GU组中的蛋白质丰度显著高于CK组而GN组与CK组之间无显著差异。推测外源GU促进红球藻CO2固定，使光合电子产生的NADPH及时耗尽，从而防止了过量NADPH的累积而加剧光抑制（图5）。

　　图4 外源添加GU和GN后红球藻的代谢变化

　　图5 高光处理下光合机构蛋白质水平的变化考虑到上述结果排除了代谢调节和结构蛋白表达在GU和GN减轻光损伤中的作用，因此推测光保护途径可能起主导作用。非光化学淬灭NPQ可以将多余的吸收光能作为热量耗散，这是由质子梯度（ΔpH）的建立和叶黄素循环的活性触发的。强光照射后，GU和GN组的NPQ明显高于CK组。这表明外源GU和GN能促进红球藻的NPQ，且蛋白质丰度增加，与其NPQ活性变化一致。环式电子传递（CEF）和叶绿体呼吸被认为在调节光合作用和减轻光损伤方面起着关键作用。CEF分为CEF-PSII和CEF-PSI。在三组试验中，CEF-PSII无明显变化。GU和GN在相移前均显示出升高的CEF-PSI活性，但CK组在强光处理6h后才表现出升高的CEF-PSI活性。在强光暴露前，GU和GN的叶绿体呼吸活性明显高于CK组。这些结果表明，外源性GU和GN胺迅速触发替代电子流（AEF），包括CEF-PSI和氯呼吸，帮助红球藻在相移期间消耗多余的激发能量。轻微的差异是GU在促进CEF-PSI方面更有效，而GN优先促进叶绿体呼吸。

　　图6 强光处理下红球藻光保护途径活性的变化综上所述，在相移前补充GU和GN可缓解突发强光胁迫对红球藻的光损伤。GU可迅速增强CO2固定，同时诱导多种光保护途径，包括非光化学猝灭、循环电子流、叶绿体呼吸和光呼吸，从而维持红球藻在突发环境转变期间光吸收和能量利用之间的平衡，从而防止PSII供体侧和受体侧的损伤。在黑暗中谷氨酸预激活了这些光保护途径，从而在相移突变后能够无缝适应强光胁迫。同时，GN在诱导多种光保护途径方面表现出相当的功效。这些发现为研究微藻和高等植物在快速环境变化下的光保护驯化机制提供了理论依据。

　　图7 外源GU和GN如何减轻强光下红球藻光抑制的示意图