Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片,还是具有一定挑战性的。我们在做蛋白电泳和Western Blot时,多数都用的Bio-Rad公司的仪器和abcam公司抗体,所以Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家,因为每天都有很多人向他们请教。他们就将最常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分,希望能帮你节省一些查资料的时间。
品牌 |
抗体名称 |
货号 |
规格 |
市场价 |
促销价 |
Abcam |
Anti-Chk2 (phospho T387) |
ab55319 |
100 µg |
3996.00 |
3196.00 |
Abcam |
Anti-Chk1 [EPR3952] |
ab133277 |
100 µl |
4175.00 |
3340.00 |
Abcam |
Anti-CDKN2A |
ab189034 |
50 µg |
3996.00 |
3196.00 |
Abcam |
Anti-ATR抗体[2B5] |
ab4471 |
100 µg |
4255.00 |
3404.00 |
Q:我的结果是膜上一片空白。为什么会这样?
A:导致这种结果的因素很多。
胶和膜放反了 如果在转印的过程中,胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中,而不会到达膜上。对于标准的转印,凝胶应靠近三明治的负极,而膜对应正极。
转膜效率低 转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的pH值。一般说来,蛋白越大,转移得越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
在转印之后,你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率,Bio-Rad也提供了多种预染Marker,它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。试剂放置太久或存放条件不正确 抗体会慢慢降解,如果反复冻融的话,它会快速降解。底物应储存在-20°C。
抗体不纯或滴度太低 一抗的浓度差异很大,应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及,太多的抗体也会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。
酶失活了 叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。另外,自来水或用聚苯乙烯树脂去离子的水也可能会使酶失活,只能使用蒸馏的去离子水。
使用Tween-20洗涤 Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用,或洗走NC膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%,但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤,其他洗涤过程中都不使用Tween-20,不过,这可能会使背景升高。
检测系统缺乏足够的灵敏度 确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内:
辣根过氧化物酶 500 pg/band
碱性磷酸酶 100 pg/band
增强的碱性磷酸酶 5 pg/band
胶体金 100 pg/band
增强的胶体金 10 pg/band
Immun-Star 化学发光 10 pg/band
Q:我的western blot总是背景过高,如何解决?
A:背景过高可能是由很多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
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