按照BSL-4标准建造的实验室，也称为高度实验室生物安全。实验室为独立的建筑物，或在建筑物内一切其它区域相隔离的可控制的区域。为防止微生物传播和污染环境，BSL-4实验室必须实施特殊的设计和工艺。在此没有提到的BSL-3要求的各条款在BSL-4中都应做到。其具体的标准微生物操作、特殊操作、安全设备和实验室设施要求如下：
4.1标准操作
(1)限制进入实验室的人员数量。
(2)制定安全操作利器的规程。
(3)减少或避免气溶胶发生。
(4)工作台面每天至少消毒一次，任何溅出物都要及时消毒。
(5)一切废弃物在处理前要高压灭菌。
(6)昆虫和啮齿类动物控制按有关规定执行。
(7)严格控制菌、毒种(见前)。
4.2特殊操作
(1)人员进入
只有工作需要的人员和设备运转需要的人员经过系统的生物安全培训，并经过批准后方能进入实验室。负责人或监督人有责任慎重处理每一个情况，确定进入实验室工作的人员。采用门禁系统限制人员进入。进入人员由实验室负责人、安全控制员管理。人员进入前要告知他们潜在的生物危险，教会他们使用安全装置。工作人员要遵守实验室进出程序。制定应对紧急事件切实可行的对策和预案。
(2)危害警告
当实验室内有传染性材料或感染动物时，在所有的入口门上展示危险标志和普遍防御信号，说明微生物的种类、实验室负责人和其他责任人的名单和进入此区域特殊的要求。
(3)负责人职责
实验室负责人有责任保证，在BSL-4内工作之前，所有工作人员已经高度熟练掌握标准微生物操作技术、特殊操作和设施运转的特殊技能。这包括实验室负责人和具有丰富的安全微生物操作和工作经验专家培训时所提供的内容和安全委员会的要求。
(4)免疫接种
工作人员要接受试验病原体或实验室内潜在病原微生物的免疫注射。
(a)血清学监督：对实验室所有工作人员和其他有感染危险的人员采集本底血清并保存，再根据操作情况和实验室功能不定期血样采集。进行血清学监督。对致病微生物抗体评价方法要注意适用性。项目进行中，要保证每个阶段血清样本的检测，并把结果通知本人。
(b)安全手册：制定生物安全手册。告知工作人员特殊的生物危险，要求他们认真阅读并在实际工作当中严格执行。
(c)技术培训：工作人员必须经过操作最危险病原微生物的全面培训，建立普遍防御意识，学会对暴露危害的评价方法，学习物理防护设备和设施的设计原理和特点。每年训练一次，规程一旦修改要增加训练次数。由对这些病原微生物工作受过严格训练和具有丰富工作经验的专家或安全委员会指导、监督进行工作。
(d)紧急通道只有在紧急情况下才能经过气闸门进出实验室。实验室内要有紧急通道的明显标识。
(e)在安全柜型实验室中，工作人员的衣服在外更衣室脱下保存。穿上全套的实验服装(包括外衣、裤子、内衣或者连衣裤、鞋、手套)后进入。在离开实验室进入淋浴间之前，在内更衣室脱下实验服装。服装洗前应高压灭菌。在防护服型实验室中，工作人员必须穿正压防护服方可进入。离开时，必须进入消毒淋浴间消毒。
(f)实验材料和用品要通过双扉高压灭菌器、熏蒸消毒室或传递窗送入，每次使用前后对这些传递室进行适当消毒。
(g)对利器，包括针头、注射器、玻璃片、吸管、毛吸管和解剖刀，必须采取高度有效的防范措施。尽量不使用针头、注射器和其它锐利的器具。只有在必要时，如实质器官的注射、静脉切开或从动物体内和瓶子里吸取液体时才能使用，尽量用塑料制品代替玻璃制品。在注射和抽取传染性材料时，只能使用锁定针头的或一次性的注射器(针头与注射器一体的)。使用过的针头在处理之前，不能折弯、折断、破损，要精心操作，不要盖上原来的针头帽;放在固定方便且不会刺破的用于处理利器的容器里。不能处理的利器，必须放在器壁坚硬的容器内，运输到消毒区，高压消毒灭菌。可以使用套管针管和套管针头、无针头注射器和其它安全器具。破损的玻璃不能用手直接操作，必须用机械的方法清除，如刷子、簸萁、夹子和镊子。盛污染针头、锐利器具、碎玻璃等，在处理前一律消毒，消毒后处理按照国家或地方的有关规定实施。
(h)从BSL-4拿出活的或原封不动的材料时，先将其放在坚固密封的一级容器内，再密封在不能破损的二级容器里，经过消毒剂浸泡或消毒熏蒸后通过专用气闸取出。
(i)除活体或原封不动的生物材料以外的物品，除非经过消毒灭菌，否则不能从BSL-4拿出。不耐高热和蒸汽的器具物品可在专用消毒通道或小室内用熏蒸消毒。
(j)完成传染性材料工作之后，特别是有传染性材料溢出、溅出或污染时，都要严格彻底地灭菌。实验室内仪器要进行常规消毒。
(k)传染性材料溅出的消毒清洁工作，由适宜的专业人员进行。并将事故的经过在实验室内公示。
(l)建立报告实验室暴露事故、雇员缺勤制度和系统，以便对与实验室潜在危险相关的疾病进行医学监督。对该系统要建造一个病房或观察室，以便需要时，检疫、隔离、治疗与实验室相关的病人。
(m)与实验无关的物品(植物、动物和衣物)不许进入实验室。
4.3安全设备(初级防护屏障)
在设施污染和半污染工作区域内的一切操作都应在Ⅲ级生物安全柜内进行。如工作人员穿着具有生命支持通风系统的正压防护服，可在Ⅱ级生物安全柜内进行实验操作。
4.4实验室设施(次级防护屏障)
BSL-4实验室有两种类型：安全柜型，即所有病原微生物的操作均在Ⅲ级生物安全柜内或隔离器进行;防护服型，即工作人员穿正压防护服工作，操作可在Ⅱ级生物安全柜内进行。也可以在同一设施内穿正压防护服，并使用Ⅲ级生物安全柜。
(1)安全柜型
BSL-4建筑物或独立，或在系统建筑中由一个清洁区或隔墙把它与其它区域隔离开。中心实验室(污染区)装有Ⅲ级生物安全柜，实验室周围为足够宽的隔离带，如环形走廊(半污染区)。从隔离带进出实验室必须通过一个缓冲间。在污染区和半污染区之间，安装两台以上生物安全型高压蒸汽灭菌器(一次灭菌)，互为备用。外更衣室(清洁区)与内更衣室(半污染区)由淋浴间(清洁区)隔开，人员进出经过淋浴间。在清洁区与半污染区之间设置一个通风的双门传递通道，为不可通过更衣室进入实验室的实验材料、实验用品或仪器通过物理屏障时提供通道和消毒。在清洁区与半污染区之间同样安置一台生物安全型高压灭菌器，用于二次消毒。每天工作开始之前，检查所有物理防护参数(如压差)。
实验区的墙、地和天棚整体密封，便于熏蒸消毒。内表面耐水和化学制剂、便于消毒。实验区任何液体必须排放到有消毒装置的储液罐，经过有效灭菌达标排放。通风口和在线管道都要安装HEPA过滤器。工作台面不渗水，耐中等热、有机溶剂、酸、碱和常用消毒剂的腐蚀。
实验室用具事先设计，便于安放稳妥和使用，彼此留有一定空间便于清洁卫生，桌椅表面易于消毒。内外更衣室和实验室进出门附近安装非手动或自动开关的洗手池。排风经过2个串连的HEPA过滤，送、排风过滤器安装应便于消毒和更换。供水、供气均安装防止回流的装置加以保护。如果提供水源(消防喷枪)，其开关应该是安装在实验室外面走廊里，开关自动或非手动。此系统与实验室区域供水分配系统分开，配备防止回流装置。实验室进出门自动锁闭。实验室内所有窗户都必须是封闭窗。从Ⅲ级安全柜和实验室传出的材料必须经双扉高压灭菌器灭菌。灭菌器与周围物理屏障的墙之间要密封。灭菌器的门自动连锁控制，以保证只有在灭菌过程全部完成后才能开启外门。从Ⅲ级安全柜或实验室内要拿出的材料和仪器，不能用高压灭菌消毒的要通过液体浸泡消毒、气体熏蒸消毒或同等效果的消毒装置进行消毒和传递。来自内更衣室(包括厕所)和实验室内的洗手、地漏、高压灭菌器的废水以及其它废水，在排入公共下水之前，都要使用可靠的方法消毒(热处理比较合适)。淋浴和清洁区一侧厕所的废水不需特殊处理就可排入公共下水。所用废水消毒方法必须具有物理学和生物学的监测措施和法规确认。
非循环的负压通风系统，供、排风系统应采用压力无关装置保持动态平衡，保证气流从最低危险区向最高危险区的方向流动。对相邻区域的压差或气流方向进行监测，能进行系统声光报警。应安装一套能指示和确认实验室压差、适用而可视的气压监测装置，其显示部分安装在外更衣室的进口处。Ⅲ级生物安全柜与排风系统相连。
实验室的供排气都要经过HEPA过滤。为了缩短工作管道潜在的污染，HEPA尽可能安装在靠近工作的地方。所有HEPA每年均须检测一次，同时在靠近HEPA的地方应安装零泄露气密阀，便于过滤器安装与消毒更换。HEPA上游安装预过滤器可延长其使用寿命。
安全柜型生物安全水平Ⅳ级实验室的设计和操作程序是指令性的。实验室必须经过检测、鉴定和验收。只有合乎设计要求和运行标准的才能启用。实验室的验收或年检应参考ISO10648标准检测方法进行密封性测试，其检测压力不低于500Pa，半小时的小时泄漏率不超过10%，以保证维护结构的可靠性。实验室每年必须检测一次，确认合乎设计和运行参数的要求，才能继续运行。实验室内外应有适合的通讯联系设施(电话、传真、计算机等)，进行无纸化操作。
(2)防护服型
BSL-4建筑物独立，或在系统建筑中由一个清洁区或隔墙把它与建筑物其它区域隔开。实验室房间的安排与安全柜型基本相同。不同的是在进入实验室(可用Ⅱ级生物安全柜代替Ⅲ级生物安全柜)之前要穿上有生命支持系统的正压防护服。生命支持系统所供气体应满足可呼吸空气生产标准，同时应增加紧急排风设施及配有备用电源。进入BSL-4实验室之前要设置一个更衣和消毒区(设在实验室的一角或环形走廊内侧)。工作人员离开此区之前应在专用消毒室对防护服表面进行药物喷淋和熏蒸，时间不短于5分钟。备用电源，在停电时应能够保证排风、生命支持系统、警铃、灯光、进出控制和生物安全柜的应急工作。所有通向实验区、消毒淋浴室、气闸的空隙都要封闭。每天实验开始之前，要完成对所有物理防护参数(如压差等)和正压防护服的检测，以保证实验室安全运行。在实验区跨墙安装双扉高压灭菌器，对从实验区拿出的废弃物进行一次消毒。高压灭菌器与物理防护的壁板间要密闭。
设置渡槽、熏蒸消毒传递小室(柜)，供不能通过更衣室进入实验区的实验材料、用品或仪器的消毒和传递使用。这些设施还能用于不能高压的材料、用品和仪器安全地取出。在清洁区与半污染区之间同样安置一台双扉生物安全型高压灭菌器，用于二次消毒。实验区的墙、地和天棚整体密封，便于熏蒸消毒。内表面耐水和化学制剂、便于消毒。实验区任何液体必须排放到有消毒装置的储液罐，经过有效灭菌达标排放。通风口和在线管道都要安装HEPA过滤器。实验区内部附属设施，如灯的固定、空气管道、功能管道等的安排尽可能减少水平表面面积。工作台面不渗水，中等耐热、抗有机溶剂、酸、碱和常用消毒剂的腐蚀。
实验用具要简单、分体、适用、牢固，不选用多孔材料。桌、柜、仪器之间保持一定空间，便于清洁和消毒。实验用椅和其它用具的表面应易于消毒。实验区、内外更衣室的洗手池设非手动开关。中央真空系统设在实验区内，在线HEPA过滤器靠近每一个使用点或开关。过滤器安装便于消毒和更换。其它进入实验区的供水、供气由防止回流装置加以控制。
实验区的门采用门禁系统。消毒淋浴、气闸室的内外门连锁。来自污染区内的洗手池、地漏、灭菌器和其它来源的废水必须排放到有消毒装置的储液罐，经过有效灭菌达标排放。来自淋浴和厕所的废水经处理后排入下水道。所用的废水消毒方法的效果要有物理学和生物学的证据。
全新风通风系统。供、排风系统应采用压力无关装置保持动态平衡，保证气流从最低危险区向最高危险区的流动。对相邻区域的压差或气流方向进行监测，能进行系统声光报警。应安装一套能指示和确认实验室压差、适用而可视的气压监测装置，其显示部分安装在外更衣室的进口处。
实验区的供气要通过一个HEPA过滤处理，排气要通过串连的2个HEPA过滤处理。空气向高空排放，远离进气口。为了缩短工作管道潜在的污染，HEPA尽可能安装在靠近工作的地方。所有HEPA每年均须检测一次，同时在靠近HEPA的地方应安装零泄露气密阀，便于过滤器安装与消毒更换。HEPA上游安装预过滤器可延长其使用寿命。
防护服型生物安全Ⅳ级实验室设计和运转要求是指令性的。实验室必须经过检测、鉴定和验收。只有合乎设计要求和运行标准的才能启用。实验室的验收或年检应参考ISO10648标准检测方法进行密封性测试，其检测压力不低于500Pa，半小时内的小时泄漏率不超过10%，以保证维护结构的可靠性。实验室每年必须检测一次，确认合乎设计和运行参数的要求，才能继续运行。实验室内外应有适合的通讯联系设施(电话、传真、计算机等)，进行无纸化操作。
